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安捷伦液相色谱仪1260测定乳制品中的双氰胺
更新时间:2019-07-29   点击次数:1775次

双 氰 胺(dicyandiamide,DCD)又 称 二 氰 二 胺,分子式 为C2N4H4。双 氰 胺 是 一 种 白色 结 晶 粉 末,可溶于水,是一种重要的有机化工原料,可用于生产三 聚 氰 胺,在 医 药 工 业 中 也 可 以 用 于 制 取硝 酸 胍和 磺 胺 类 药 物,还 可 以 用 于 固 色 剂、黏 合 剂 等,农业上用于对肥料的凝固作用,防止肥料流失,对肥料中的硝酸盐类(如硝酸钾)、胺类化合物进行中和,减少该类化学物质的有害作用。双氰胺对人 体 是否有害以及含量多少会对人体产生危害目前尚没有明确的研究结 论,还需要进行毒理研究。但 双 氰 胺是含氮量高且性 质 较 稳 定 的 非 蛋 白 氮 物质,少 量 加入不影响食品风 味;由 于 目 前 国 家 标 准 规 定 的 蛋 白质测定方法基于 凯 氏 定 氮 法,样品中任何含氮物质均折算成蛋白质含量,因此很可能被不法商家利用,非法添加到食品中。

本文建立了乳制品中双氰胺的液相色谱-紫外检测法,优化 了 前 处 理 方 法 和 高 效液 相 色 谱 条 件。该 方法 简 便、快 速、有 效,适 用 于 乳制品中双氰胺的检测。

一、实验部分

1.1仪器、设备和试剂

Agilent1260高 效 液 相 色 谱 仪(配 二 极 管 阵 列检测器);乙 腈、甲 酸(色 谱 纯,Merck公司);试 验 用水为Milli-Q超 纯 水。标 准 物 质:双 氰 胺(纯 度99.4%,Sigma-Aldrich公司)。

双 氰 胺 标 准 溶 液 的 配 制:准 确 称 取100mg双氰胺标准品于100mL容量 瓶 中,用 水 溶 解,配 制 成1.0g/L的储备液。用流动相 将 标 准 储 备 液 稀 释 成0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0mg/L的系列标准溶液。

1.2色谱条件

液相色谱 柱:XBridgeAmide柱(250mm×4.6mm,3.5μm,Waters公 司);柱 温:35°C;进 样 量:20μL;流动相:乙 腈-水(体 积 比 为90∶10)(含 体 积分数为0.2%的 甲 酸);流 速:1.0mL/min;检 测 波长:218nm。

1.3样品前处理

称取固态、半固态样品(奶粉、炼 乳 等)1g(精 确到0.01g)或 液 态 样 品(纯 奶、酸 奶 等)2g(精 确到0.01g),置于10.0mL比色管中,固态、半固态样品加入3mL70°C热水,液态样品加 入1mL70°C热水 充分涡旋2min,置于70°C热水浴中15min充分溶解提取,冷却至 室 温,涡 旋 中 分3次 加 入 乙 腈,每次加入2mL,zui后用乙腈定容至10.0mL,涡 旋 摇匀,取2mL液体至2mL离 心 管 中,以8000r/min离心10min,取1.0mL上 清 液 于50°C下 氮 气 吹干,用1.0mL流 动 相 溶 解,过0.45μm滤 膜,滤 液供HPLC分析。

二、安捷伦液相色谱仪1260结果与讨论

2.1色谱条件的优化对双氰 胺 标 准 溶 液 进 行 光 谱 扫 描,发 现 在218nm处有zui大吸收,确定其检测波长为218nm。

双 氰 胺 在C18柱 上 几 乎 无 保 留。双 氰 胺 的 性质和三聚氰胺类 似,因 此 试 图 采 用 与 三 聚 氰 胺 检测相同的多种离子对试剂如庚烷磺酸钠等作为流动相,但是没有达 到 预 期 效 果。基于双氰胺的性质,采 用 了XBridgeAmide柱 作 为 分 离 柱。选 择 不同比例的乙腈-水作为流动相,对 双 氰 胺 标 准 溶 液 进行测定,没有出现目标物色谱峰,加入少量甲酸后,得到相应的目标物色谱峰。通过实验zui终确定以含0.2%甲酸的乙腈-水(90/10,v/v)作 为 流 动 相 时,目标峰的峰形和保 留 时 间 zui 佳,并且目标峰的保留时间为5min左 右,大大减少了基质对目标峰的干扰作用,优化条件下的标准溶液色谱图见图1。

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2.2安捷伦液相色谱仪1260前处理方法的建立

乳制品基质 比 较 复 杂,对检测的主要干扰物为脂肪和蛋白质,因 此 除 去 脂 肪 和 蛋 白 质 的 干 扰 zui 为关键。综合考虑 采 用 有 机 试 剂 沉 淀 蛋 白 质,便 于 后续样品的处理。

直接用乙腈 进 行 定 容 后 涡 旋 超 声 提 取,发 现 回收效果不稳定,回收率差异较大,且乳制品中的蛋白质往往黏结成 块状。推 测 在 乙 腈 快 速 加 入 后,蛋 白质迅速黏结包夹了部分双氰胺。考察了缓慢加入乙腈对蛋白质沉淀和回收率的影响。结 果 表 明,在 涡旋条件下,缓慢加 入 乙 腈 能 有 效 地 防 止 蛋 白 质 迅 速黏结,蛋白质呈分散状态,回收率高且稳定。另外还考察了超声提取对回收率的影响,结果表明,在涡旋过程中缓慢加入乙腈后超声与否不影响提取效果。故本文采用在涡旋过程中缓慢加入乙腈的提取方式。

实验 发 现 将 上 述 提 取 液 过 微 孔 滤 膜 后 直 接 进样,样色 谱 图 会 有 很 高 的 溶 剂 峰。取1.0mL提取液于50°C下 氮 气 吹干,再 用1.0mL流 动 相 溶解,过滤膜,滤液供HPLC分 析,则 样 品 色 谱 图 中 的溶剂峰消失,因此,样品提 取 后 取1.0mL提 取 液 用氮气吹干,再用流动相重新溶解样品,供色谱检测。

2.3安捷伦液相色谱仪1260线性范围、检出限和定量限

对双氰胺的 标 准 溶 液 进 行 检 测,以 仪 器 响 应 的峰面积Y对双氰胺的质量浓度X进行线性回 归,双氰胺在0.5~50mg/L范 围 内 的 线 性 关 系 良 好,回归方程 为Y=153.87X+21.56,相 关 系 数(r2)为0.9999。在空白样品处理液 中 添 加 双 氰 胺 标 准 品,以S/N=3确定方法的检出限,以S/N=10确 定 方法的定量限,得到双氰胺的检出限为0.2mg/kg,定量限为0.5mg/kg。

2.4回收率和精密度

对乳粉(经确认不含双氰胺)样品进行回收率试验,添加水平分别为1.0、2.0和5.0mg/kg,采 用 优化后的前处理方 法 对 样 品 进 行 处 理,每 个 添 加 水 平重复6次,平 均 回 收 率 分 别 为101.0%、96.7%和99.7%,RSD分别为4.8%、4.5%和4.9%(见表1)。

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2.5实际样品测定

采用本方法对鲜奶、酸奶、炼乳、乳粉等40批乳制品进行检测,结果均未检出双氰胺。

三、安捷伦液相色谱仪1260结论

利用液相色谱法对乳制品中的双氰 胺 进 行分 析,该方法优化了XBridgeAmide柱的分析条件,色谱峰保留 时 间 优 化 为5min左 右,大 大 降 低 了 基质的干扰,方法简 单 快 速,准 确 度 和 精 密 度 高,适 用于各种乳制品中双氰胺的检测。采用乙腈作为沉淀剂能有效地沉淀蛋白质,消除蛋白质干扰,从而保障了该方法对乳制品中双氰胺分析的准确性。本方法适用于乳制品中双氰胺的分析和质量控制。

 

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