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液相色谱仪分析啤酒花浸膏中的 6 种酸性成分
更新时间:2019-09-19   点击次数:2106次

本文采用HPLC分析啤酒花浸膏中的葎草酮、合葎草酮、加葎草酮、蛇麻酮、合蛇麻酮和加蛇麻酮6种同系化合物,通过优化色谱条件,在等度洗脱条件下实现了其中两对难分离同分异构体的基线分离;收集这6种组分并对其进行了紫外(UV)光谱、红外(IR)光谱和质谱(MS)表征。

1液相色谱仪分析啤酒花浸膏中的 6 种酸性成分的实验部分

1.1仪器和药品

P230II高压恒流泵,UV230II紫外-可见波长检测器,ZW色谱柱恒温箱;7725i手动进样阀(美国Rheodyne公 司) ;Finnigan液 相 色 谱-质 谱 联 用 仪(美 国Thermo公司) ;TU-1810APC紫外-可见分光光度计;EQUINOX55型傅里叶变换红外光谱仪(德国BRUKER公司)。

甲醇、乙腈、乙醇(色谱纯) ;磷酸(分析纯) ;实验用水由Milli-Q纯水系统(美国Millipore公司)制备;啤酒花浸膏。

1.2样品制备

称取1.0056g浸膏于5mL离心管中,在30°C水浴中超声振荡,用30mL甲醇分多次将样品转移至50mL烧杯中,在水浴中超声振荡30min后转移至100mL容 量 瓶 中,用 甲 醇 定 容,充 分 混 匀。取19.0mL上述溶液于50mL容量瓶中,用甲醇定容,混匀,用0.45μm油膜过滤,滤液供分析。样品应在避光、低温条件下保存。

1.3分析条件

HPLC条件:HypersilODS2色谱柱(250mm×4.6mm,5μm) ,流动相为乙腈-0.1%(v/v)磷酸水溶液(pH2.2) (65∶35,v/v) ,流速为1.0mL/min,检测波长为315nm,进样量为20μL,柱温为室温。

UV光谱条件:样品用乙腈溶解,扫描波长范围为199~499nm。IR光谱条件:将样品与干燥的KBr粉末按1∶100的质量比混合,在玛瑙研钵中研磨压片,扫描范围为4500~500cm-1。

MS条件:电离方式为电喷雾电离(ESI) ,离子源温度为150.00°C,检测器电压为3.05kV,质量扫描范围为m/z300.00~1000.00,一级全扫描质谱分析。

2液相色谱仪分析啤酒花浸膏中的 6 种酸性成分的结果与讨论

2.1色谱条件的优化

2.1.1磷酸的影响

以甲醇-水(含0.26%磷酸或磷酸调节pH为2.5)为流动相分析啤酒花浸膏中的α-酸和β-酸为参考,考察了酸的加入对HPLC分离啤酒花浸膏中的α-酸和β-酸的影响。从图2a中可以看出,不加酸时色谱峰展宽,且严重拖尾,分离度低;加入0.1%(v/v)磷酸后目标物的出峰时间比不加酸时滞后了3~4min(见图2b) ,其原因可能是不加酸时啤酒花浸膏样品中的有效成分解离,以离子形式存在,在C18柱中保留相对较弱,导致出峰提前;加入酸使流动相的酸度增加,抑制了目标物在溶剂中的解离,使目标物峰的峰形得到改善,柱效增加,样品的分离度也明显提高。

2.1.2有机溶剂的影响

考察了分别以甲醇、乙醇及乙腈作为流动相中的有机相对啤酒花浸膏的HPLC分离效果。从图3a可知,以甲醇作有机相时大保留时间大于350min,且组分2和3没有达到基线分离;从图3b可知,以乙醇作有机相时可分出4种组分,分别为合葎草酮(1)、葎草酮与加葎草酮合峰(2+3)、合蛇麻酮(4)、蛇麻酮与加蛇麻酮合峰(5+6) ,两对同分异构体都没有得到很好的分离;从图3c可知,乙腈的选择性相对较好,用其作有机相时柱压较小,且6种组分均得到了较好的分离,两对同分异构体的分离度(Rs)分别为1.58和1.55,均实现了基线分离,故选择乙腈作流动相的有机相。

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2.1.3温度的影响

在色谱分离中,色谱柱温度的改变会影响样品的分离度及保留时间,故有考察的必要。研究结果表明,温度每上升5°C,分离时间缩短约5min(以组分5计) ,两对同分异构体的分离度变化如表1所示。

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柱温从室温(25°C)上升到35°C时,组分2和3及5和6的分离度分别下降12.7%和18.7%,分离度均低于1.5,不能达到基线分离的要求[12];温度上升到45°C时,组分5和6的分离度下降了约30%。温度的升高虽然使保留时间提前,但分离度相应地降低,使两对同分异构体的分离效果变差,不能达到基线分离,故选择柱温为室温。

2.2有效成分的制备与表征

2.2.1有效成分的制备

取1.2节中所制备的样品在*分离条件下进样,按出峰时间收集6种组分(合葎草酮、葎草酮、加葎草酮、合蛇麻酮、蛇麻酮、加蛇麻酮) ,分别记为I、II、III、IV、V和VI。按1.3节所述的分析条件分别对收集的6个组分进行HPLC分析,检测其纯度。通过面积归一化法测得6种组分的纯度分别为98.2%、94.3%、96.6%、93.2%、92.6%和90.2%。

2.2.2结构表征

(1)UV光谱:组分I的UV光谱如图4所示,其大紫外吸收波长(λmax)为227nm;从其余5种组分的UV光谱(图略)可见其λmax分别为222、222、323、321和323nm。在320nm左右有强的UV吸收带说明结构式中有3个共轭双键,且此处的吸收谱带说明还有外环羟基的作用。羟基是助色基团,其与苯环连接,形成n-π共轭导致其大吸收波张红移至220nm左右有大吸收波长;大于270nm处的谱带是由于结构式中的羰基的紫外吸收所致;在222nm、227nm处的吸收主要是由于六元环上的烯醇式-酮式互变作用引起。

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(2)IR光谱:组分I的IR光谱见图5(其余5种组分的IR光谱图略)。该化合物在3412cm-1的吸收谱带是羟基的伸缩振动吸收峰;在2975~2840cm-1有3个强吸收谱带,说明分子内有甲基、次甲基、亚 甲 基 的C-H对称与不对称伸展振动;1467cm-1的谱带说明分子中含有甲基或乙基;1378cm-1处的吸收谱带证实有甲基存在;1525~1680cm-1处的一组谱带是六元环共轭体系C=C和邻 接C=O的 伸 缩 振 动 吸 收 区;1200~1000cm-1处的吸收带表示六元环上的碳氢面内的弯曲振动,说明环上有邻、间、对位取代基。该表征结果与其结构吻合。

(3)LC-MS:组分I的质谱图见图6,可以看出其准分子离子峰为m/z348.96;其余5种组分的准分子 离 子 峰 分 别 为m/z362.92、362.96、400.94、414.94、414.96,6种组分的分子式分别为C20H28O5、C21H30O5、C21H30O5、C25H36O4、C26H38O4、C26H38O4,MS表征结果与理论值一致。

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通过UV光谱、IR光谱和MS对收集的6种组分进行表征,结果与其结构吻合,确认所收集的组分I为合葎草酮,II为葎草酮,III为加葎草酮,IV为合蛇麻酮,V为蛇麻酮,VI为加蛇麻酮。

3液相色谱仪分析啤酒花浸膏中的 6 种酸性成分结语

建立了HPLC同时测定啤酒花浸膏中6种活性组分的方法,在等度洗脱下实现了两对难分离同分异构体的基线分离。该法具有简便、稳定、分离度好等优点,可用于啤酒花浸膏中酸性成分的分析。

 

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