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液相色谱仪HPLC 测定玫瑰花中原花青素B2 的含量
更新时间:2016-02-17   点击次数:2550次

1 实验仪器和材料

1.1 仪器

RE-52AA 旋转蒸发器;UV-752N 紫外分光光度计;Agilent1260 液相色谱仪;色谱柱:Phenomenex Luna (250 mm×4.6 mm,5 μm)C18柱;AB- 8 型大孔树脂;梅特勒电子天平。

1.2 材料

干玫瑰花,平阴产丰花;原花青素B2标准品(质量分数> 95%);甲醇(一级色谱纯);实验用水为娃哈哈纯净水;其余化学试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Phenomenex Luna250mm×4.6 mm5μmC18柱;流动相:2%冰醋酸水溶液甲醇,梯度洗脱,洗脱时间程序见表1;进样量:20 μl;检测波长:280 nm;流速:1 ml·min-1;柱温:30 ℃。色谱图见图12

 

2.2 实验方法

2.2.1 对照品溶液的制备

精密称取原花青素B2标准品5.14 mg, 置10 ml 的容量瓶中, 加甲醇稀释至刻度,配制成514 μg·ml-1 的原花青素B2的标准储备液,再精密吸取1 ml、1.5 ml、2 ml、2.5 ml、3 ml 的原花青素B2的标准储备液,用甲醇稀释到10 ml,配成51.4μg·ml-1、77.1 μg·ml-1、102.8 μg·ml-1、128.5 μg·ml-1、154.2 μg·ml-1 的原花青素B2的标准溶液,用装有0.22μm 微孔滤膜的滤器进行过滤,弃去初滤液,即得。

2.2.2 样品溶液的制备

精密称取1.0 g 玫瑰花粉末, 以60%乙醇作为溶剂, 以40∶1 的液料比, 在30 ℃条件下超声提取10 min,抽滤,低温减压蒸发浓缩,浓缩液溶于蒸馏水得原花青素B2粗提物。然后在处理好的AB-8 型大孔树脂的层析柱(20 cm×1 cm)上样,上样量为25 ml,上样后先用3BV 的蒸馏水洗至洗脱液无色,再用3BV40%的乙醇洗脱,洗脱速度为1 ml·min-1,收集洗脱液,将洗脱液低温旋转蒸发浓缩,将洗脱液蒸干后用甲醇稀释溶解定容到10 ml, 制成经大孔树脂吸附纯化后的玫瑰花原花青素B2的提取物。用装有0.22 μm 微孔滤膜的滤器进行过滤,弃去初滤液,备用。

2.2.3 标准曲线及线性范围

取上述标准系列溶液各20 μ进样,测得峰面积,以原花青素B2标准品的峰面积(Y)对于浓度(X)进行回归,得标准曲线为:Y=5.3277X+5.9613R2=0.9998。在51.4154.2 μg·ml-1 范围内,对照品浓度与峰面积呈良好线性关系,见图3

 

 

2.2.4 精密度试验

取上述标准溶液(102.8 μg·ml-1),重复进样5 次,测得其峰面积,RSD=0.29%。测定结果表明精密度良好。

2.2.5 重复性试验

取制备好的样品溶液的续滤液20 μl 连续进样5 次,测得峰面积,RSD=1.47%。测定结果表明重复性良好。

2.2.6 稳定性试验

取上述对照品溶液(102.8 μg·ml-1),分别于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h,测定1 次,计算其峰面积的RSD(n=5)为0.49%。结果表明对照品在12 h 内稳定性较好。

2.2.7 回收率

准确加入已知浓度原花青素B2标准品2.5 ml,再准确加入相同浓度的原花青素B2标准品2 ml,甲醇定容至10 ml,用装有0.22μm 微孔滤膜的滤器进行过滤,弃去初滤液,取20 μl 续滤液以备进样,测得峰面积,代入回归方程,求得相对应的原花青素B2的浓度。结果平均回收率为98.35%,RSD=1.24%(n=5) 。

2.2.8 样品含量测定

各样品按2.2.2 项下制备成供试液,按2.1 色谱条件下测定其峰面积,利用标准曲线计算样品中原花青素B2的含量,结果见表2。

 

 

3 讨论

本实验运用HPLC 法对玫瑰花原花青素提取物进行了定性定量分析。结果显示:玫瑰花原花青素提取物中存在原花青素B2,且分析了山东产地的11个品种的玫瑰花含量,其中丰花的含量zui高,紫枝的含量zui低。结果为:标准曲线为Y=5.3277X+5.9613,R2=0.9998,在标准品浓度为51.4~154.2 μg·ml-1 范围内,线性关系良好。回收率为98.35%(n=5)。zui低检出限为3.212 μg·ml-1,结果显示该方法适合用于分析玫瑰花原花青素提取物。为今后考察各产地和全国范围内的玫瑰花原花青素B2的质量标准提供了理论依据和实验参考资料。

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