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液相色谱法分析啤酒花浸膏中的 6 种酸性成分
更新时间:2016-02-19   点击次数:1693次

本文采用HPLC分析啤酒花浸膏中的葎草酮合葎草酮加葎草酮蛇麻酮合蛇麻酮和加蛇麻酮6种同系化合物,通过优化色谱条件,在等度洗脱条件下实现了其中两对难分离同分异构体的基线分离;收集这6种组分并对其进行了紫外(UV)光谱红外(IR)光谱和质谱(MS)表征

1实验部分

11仪器和药品

P230II高压恒流泵,UV230II紫外-可见波长检测器,ZW色谱柱恒温箱;7725i手动进样阀(美国Rheodyne ) ;Finnigan   -    ( Thermo公司) ;TU-1810APC紫外-可见分光光度计;EQUINOX55型傅里叶变换红外光谱仪(德国BRUKER公司)

甲醇乙腈乙醇(色谱纯) ;磷酸(分析纯) ;实验用水由Milli-Q纯水系统(美国Millipore公司)制备;啤酒花浸膏

12样品制备

称取1.0056g浸膏于5mL离心管中,在30°C水浴中超声振荡,用30mL甲醇分多次将样品转移至50mL烧杯中,在水浴中超声振荡30min后转移至100mL   中,用    容,充   19.0mL上述溶液于50mL容量瓶中,用甲醇定容,混匀,用0.45μm油膜过滤,滤液供分析样品应在避光低温条件下保存

13分析条件

HPLC条件:HypersilODS2色谱柱(250mm×4.6mm5μm) ,流动相为乙腈-0.1%(v/v)磷酸水溶液(pH2.2) (6535v/v) ,流速为1.0mL/min,检测波长为315nm,进样量为20μL,柱温为室温

UV光谱条件:样品用乙腈溶解,扫描波长范围为199499nmIR光谱条件:将样品与干燥的KBr粉末按1100的质量比混合,在玛瑙研钵中研磨压片,扫描范围为4500500cm1

MS条件:电离方式为电喷雾电离(ESI) ,离子源温度为150.00°C,检测器电压为3.05kV,质量扫描范围为m/z300.001000.00,一级全扫描质谱分析

2结果与讨论

21色谱条件的优化

211磷酸的影响

以甲醇-(0.26%磷酸或磷酸调节pH2.5)为流动相分析啤酒花浸膏中的α-酸和β-酸为参考,考察了酸的加入对HPLC分离啤酒花浸膏中的α-酸和β-酸的影响从图2a中可以看出,不加酸时色谱峰展宽,且严重拖尾,分离度低;加入0.1%(v/v)磷酸后目标物的出峰时间比不加酸时滞后了34min(见图2b) ,其原因可能是不加酸时啤酒花浸膏样品中的有效成分解离,以离子形式存在,在C18柱中保留相对较弱,导致出峰提前;加入酸使流动相的酸度增加,抑制了目标物在溶剂中的解离,使目标物峰的峰形得到改善,柱效增加,样品的分离度也明显提高

212有机溶剂的影响

考察了分别以甲醇乙醇及乙腈作为流动相中的有机相对啤酒花浸膏的HPLC分离效果从图3a可知,以甲醇作有机相时zui大保留时间大于350min,且组分23没有达到基线分离;从图3b可知,以乙醇作有机相时可分出4种组分,分别为合葎草酮(1)葎草酮与加葎草酮合峰(2+3)合蛇麻酮(4)蛇麻酮与加蛇麻酮合峰(5+6) ,两对同分异构体都没有得到很好的分离;从图3c可知,乙腈的选择性相对较好,用其作有机相时柱压较小,且6种组分均得到了较好的分离,两对同分异构体的分离度(Rs)分别为1.581.55,均实现了基线分离,故选择乙腈作流动相的有机相

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213温度的影响

在色谱分离中,色谱柱温度的改变会影响样品的分离度及保留时间,故有考察的必要研究结果表明,温度每上升5°C,分离时间缩短约5min(以组分5,两对同分异构体的分离度变化如表1所示

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柱温从室温(25°C)上升到35°C时,组分2356的分离度分别下降12.7%18.7%,分离度均低于1.5,不能达到基线分离的要求12;温度上升到45°C时,组分56的分离度下降了约30%温度的升高虽然使保留时间提前,但分离度相应地降低,使两对同分异构体的分离效果变差,不能达到基线分离,故选择柱温为室温。

22有效成分的制备与表征

221有效成分的制备

1.2节中所制备的样品在*分离条件下进样,按出峰时间收集6种组分(合葎草酮葎草酮加葎草酮合蛇麻酮蛇麻酮加蛇麻酮,分别记为IIIIIIIVVVI1.3节所述的分析条件分别对收集的6个组分进行HPLC分析,检测其纯度通过面积归一化法测得6种组分的纯度分别为98.2%94.3%96.6%93.2%92.6%90.2%

222结构表征

(1)UV光谱:组分IUV光谱如图4所示,其zui大紫外吸收波长max)227nm;从其余5种组分的UV光谱(图略)可见其λmax分别为222222323321323nm320nm左右有强的UV吸收带说明结构式中有3个共轭双键,且此处的吸收谱带说明还有外环羟基的作用羟基是助色基团,其与苯环连接,形成n-π共轭导致其zui大吸收波张红移至220nm左右有zui大吸收波长;大于270nm处的谱带是由于结构式中的羰基的紫外吸收所致;222nm227nm处的吸收主要是由于六元环上的烯醇式-酮式互变作用引起

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(2)IR光谱:组分IIR光谱见图5(其余5种组分的IR光谱图略)该化合物在3412cm1的吸收谱带是羟基的伸缩振动吸收峰;29752840cm13个强吸收谱带,说明分子内有甲基次甲基   CH对称与不对称伸展振动;1467cm1的谱带说明分子中含有甲基或乙基;1378cm1处的吸收谱带证实有甲基存在;15251680cm1处的一组谱带是六元环共轭体系C=C和邻 C=O       ;12001000cm1处的吸收带表示六元环上的碳氢面内的弯曲振动,说明环上有邻对位取代基该表征结果与其结构吻合

(3)LC-MS:组分I的质谱图见图6,可以看出其准分子离子峰为m/z348.96;其余5种组分的准分子      m/z362.92362.96400.94414.94414.966种组分的分子式分别为C20H28O5C21H30O5C21H30O5C25H36O4C26H38O4C26H38O4MS表征结果与理论值一致

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通过UV光谱IR光谱和MS对收集的6种组分进行表征,结果与其结构吻合,确认所收集的组分I为合葎草酮,II为葎草酮,III为加葎草酮,IV为合蛇麻酮,V为蛇麻酮,VI为加蛇麻酮

3结语

建立了HPLC同时测定啤酒花浸膏中6种活性组分的方法,在等度洗脱下实现了两对难分离同分异构体的基线分离该法具有简便稳定分离度好等优点,可用于啤酒花浸膏中酸性成分的分析

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