维生素A是人体所必须的营养素之一,维生素A具有很大生理功能作用。VA进入机体后排泄效率不高,长期过量摄入可在体内蓄积,引起VA过多症。成年人长期每天摄入15000μg视黄醇当量,即可出现中毒症状,主要症状为厌食、过度激惹、恶心、呕吐、眼底水肿。*,肝中维生素A含量比较高,但对鹅肥肝检测方面的研究较少,本研究在前人检测维生素A的基础上,通过比较不同维生素A前处理方法,利用液相色谱法检测其含量。zui后选定*处理方法,该方法简单、快速、准确,适合肝类物质中的维生素A的检测。
1.化学试剂
石油醚(分析纯),**(分析纯),正己烷(色谱纯),异丙醇(分析纯),无水硫酸钠(分析纯),甲醇(色谱纯),乙醇(分析纯),氮气(分析纯),氢氧化钾(分析纯),抗坏血酸(分析纯),BHT(分析纯),维生素A标样(Singma)
2.仪器
HPLC(LabAlliance),M440型紫外检测器,旋转蒸发器,超声波,离心机,磁力搅拌器等
色谱柱:C18(250mm×4.6mm)5μ
检测器波长:325nm
维生素A标样浓度:12.3IU/mL(处理方法同样品)
3.处理方法
分别用三种方法处理样品,比较方法优劣。
3.1实验方法1
样品处理:称取10.0g均匀样品,置于100ml具塞试管中,加适量40℃热水溶解,摇振10min,加入15ml无水乙醇,1.0g抗坏血酸,摇振防结块,再加入10ml皂化液(50%KOH),在75℃水浴中皂化30min,并不时摇动。迅速冷却至室温,准确加入25.0ml萃取液(**:石油醚=1:1,V:V),振荡3min,再加入25ml蒸馏水,加塞,将试管倒转反复10次,用转速3000r/min离心管理新10min,仔细吸取上层有机相20.0ml与小试管中,通氮气浓缩至干,准确加入5.0ml甲醇,摇匀待测[7][8]。
检测器波长:325nm,流动相甲醇,进样量10μL,流速1.0mL/min。
3.2 实验方法2
样品处理:称取10.0g左右样品于研钵中,加适量甲醇,BHT及石英砂研磨,转移至皂化瓶中,加60mL乙醇,40mL50%KOH甲醇溶液,1.0mgBHT,60-75℃回流造化皂化40min。冷却后用正己烷反复提取皂化液,多次水洗至中性后,用无水硫酸钠脱水并定容至50mL5容量瓶中。取上述提取液5mL减压蒸干,用1mL甲醇溶解,经0.45μm滤膜待进样[9][10]。
检测器波长:325nm,流动相为正己烷:甲醇(87:13),进样量10μL,流速1.0mL/min。
3.3 实验方法3
样品处理:样品加入50%KOH氢氧化钾皂化,用乙迷提取,合并三次醚相,从乙迷提取液中分取10mL用氮气吹至近干,残渣用甲醇定容至10mL,过0.45μm滤膜待进样[11][12]。
检测器波长:325nm,流动相为100%甲醇,进样量10μL,流速1.0mL/min。
4.定量分析
定量方法为外标法;色谱条件为HPLC分析法。仪器平衡30min后,将一定量的表扬和样品分别进样,然后得出VA的标样及样品的峰面积。
5.结果与分析
5.1 不同处理方法所得HPLC图
将鹅肝按照方法1进行维生素A皂化,zui后将处理好的样品进行HPLC检测,结果如图1所示:
将鹅肝按照方法2进行维生素A皂化,zui后将处理好的样品进行HPLC检测,结果如图2所示:
将鹅肝按照方法3进行维生素A皂化,zui后将处理好的样品进行HPLC检测,结果如图3所示:
通过比较三种检测方法,其中方法3检测效果明显较好,故确定方法3为zui终实验方法。以下是利用方法3进行鹅肥肝和鹅肝酱VA的检测结果。
5.2 标准样品、鹅肥肝及鹅肝酱中维生素A检测的HPLC图
将标准样品、鹅肥肝及鹅肝酱按照方法3进行处理,进样分析,所得图谱如图4、图5、图6所示:
5.3 标准曲线与线性关系
分别配制不同浓度的5个标样,并将表扬依次进行分析,所得结果如下表:
表1 VA标样分析
编号 | VA标样的浓度/(IU/mL) | VA峰面积 |
1 | 10 | 231.26 |
2 | 20 | 497.45 |
3 | 30 | 743.78 |
4 | 40 | 965.14 |
5 | 50 | 1178.31 |
回归方程为y=236.18x+14.651相关系数为0.9978,由此说明此线性关系良好。zui低检出限:如进样量为10μL,则zui低检出限VA为1.2×10-9g。
5.4 鹅肥肝和鹅肝酱中维生素A 的含量及精密度实验
对同一样品进行重复5次测定,结果见表2。从变异系数看,具有良好的重现性,精密度符合要求。
表2 维生素A含量检测表及精密度检测
测量次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | M | SD | CV |
鹅肥肝VA含量(IU/g) | 17.24 | 17.08 | 17.22 | 17.18 | 17.08 | 17.16 | ±0.076 | 0.44% |
鹅肝酱VA含量(IU/g) | 3.43 | 3.43 | 3.48 | 3.37 | 3.44 | 3.43 | ±0.039 | 1.14% |
5.5 回收率实验
采用鹅肥肝作为本实验的本底样品,添加一定量的标准样品,测定回收率,结果见表3。实验发现,VA的平均回收率为98.21%,说明该法具有较好回收率。
表3 鹅肥肝维生素A回收率的测定
组别 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
样品中维生素A含量(μg/100mg) | 0.52 | 0.52 | 0.52 | 0.52 | 0.52 |
维生素A的添加量(mg) | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 |
回收测定量(mg/100mg) | 1.08 | 1.09 | 1.13 | 1.11 | 1.09 |
回收率(%) | 96.43 | 97.32 | 100.89 | 99.11 | 97.32 |
M平均回收率(%) | 98.21 | ||||
SD(%) | ±1.79 | ||||
CV | 1.82% |
6.小结
实验通过比较3种不同处理方法,确定了肝类物质中VA的HPLC检测方法;实验同时对鹅肥肝和鹅肝酱中的维生素A进行了检测,试验结果精密度较高,所采用的方法平均回收率达到98.21%,是较为准确可靠的结果。