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液相色谱仪测定鹅肥肝和鹅肝酱中维生素A
更新时间:2016-12-29   点击次数:2143次

维生素A是人体所必须的营养素之一,维生素A具有很大生理功能作用。VA进入机体后排泄效率不高,长期过量摄入可在体内蓄积,引起VA过多症。成年人长期每天摄入15000μg视黄醇当量,即可出现中毒症状,主要症状为厌食、过度激惹、恶心、呕吐、眼底水肿。*,肝中维生素A含量比较高,但对鹅肥肝检测方面的研究较少,本研究在前人检测维生素A的基础上,通过比较不同维生素A前处理方法,利用液相色谱法检测其含量。zui后选定*处理方法,该方法简单、快速、准确,适合肝类物质中的维生素A的检测。

1.化学试剂

石油醚(分析纯),**(分析纯),正己烷(色谱纯),异丙醇(分析纯),无水硫酸钠(分析纯),甲醇(色谱纯),乙醇(分析纯),氮气(分析纯),氢氧化钾(分析纯),抗坏血酸(分析纯),BHT(分析纯),维生素A标样(Singma)

2.仪器

HPLC(LabAlliance),M440型紫外检测器,旋转蒸发器,超声波,离心机,磁力搅拌器等

色谱柱:C18(250mm×4.6mm)5μ

    检测器波长:325nm

    维生素A标样浓度:12.3IU/mL(处理方法同样品)

3.处理方法

分别用三种方法处理样品,比较方法优劣。

3.1实验方法1

样品处理:称取10.0g均匀样品,置于100ml具塞试管中,加适量40℃热水溶解,摇振10min,加入15ml无水乙醇,1.0g抗坏血酸,摇振防结块,再加入10ml皂化液(50%KOH),在75℃水浴中皂化30min,并不时摇动。迅速冷却至室温,准确加入25.0ml萃取液(**:石油醚=1:1,V:V),振荡3min,再加入25ml蒸馏水,加塞,将试管倒转反复10次,用转速3000r/min离心管理新10min,仔细吸取上层有机相20.0ml与小试管中,通氮气浓缩至干,准确加入5.0ml甲醇,摇匀待测[7][8]

检测器波长:325nm,流动相甲醇,进样量10μL,流速1.0mL/min。

3.2  实验方法2

样品处理:称取10.0g左右样品于研钵中,加适量甲醇,BHT及石英砂研磨,转移至皂化瓶中,加60mL乙醇,40mL50%KOH甲醇溶液,1.0mgBHT,60-75℃回流造化皂化40min。冷却后用正己烷反复提取皂化液,多次水洗至中性后,用无水硫酸钠脱水并定容至50mL5容量瓶中。取上述提取液5mL减压蒸干,用1mL甲醇溶解,经0.45μm滤膜待进样[9][10]

检测器波长:325nm,流动相为正己烷:甲醇(87:13),进样量10μL,流速1.0mL/min。

3.3  实验方法3

样品处理:样品加入50%KOH氢氧化钾皂化,用乙迷提取,合并三次醚相,从乙迷提取液中分取10mL用氮气吹至近干,残渣用甲醇定容至10mL,过0.45μm滤膜待进样[11][12]

检测器波长:325nm,流动相为100%甲醇,进样量10μL,流速1.0mL/min。

4.定量分析

定量方法为外标法;色谱条件为HPLC分析法。仪器平衡30min后,将一定量的表扬和样品分别进样,然后得出VA的标样及样品的峰面积。

 

5.结果与分析

5.1  不同处理方法所得HPLC图

将鹅肝按照方法1进行维生素A皂化,zui后将处理好的样品进行HPLC检测,结果如图1所示:

 

 

将鹅肝按照方法2进行维生素A皂化,zui后将处理好的样品进行HPLC检测,结果如图2所示:

 

 

将鹅肝按照方法3进行维生素A皂化,zui后将处理好的样品进行HPLC检测,结果如图3所示:

 

通过比较三种检测方法,其中方法3检测效果明显较好,故确定方法3为zui终实验方法。以下是利用方法3进行鹅肥肝和鹅肝酱VA的检测结果。

5.2        标准样品、鹅肥肝及鹅肝酱中维生素A检测的HPLC图

将标准样品、鹅肥肝及鹅肝酱按照方法3进行处理,进样分析,所得图谱如图4、图5、图6所示:

 

5.3  标准曲线与线性关系

分别配制不同浓度的5个标样,并将表扬依次进行分析,所得结果如下表:

表1  VA标样分析

编号

VA标样的浓度/(IU/mL)

VA峰面积

1

10

231.26

2

20

497.45

3

30

743.78

4

40

965.14

5

50

1178.31

 

回归方程为y=236.18x+14.651相关系数为0.9978,由此说明此线性关系良好。zui低检出限:如进样量为10μL,则zui低检出限VA为1.2×10-9g。

5.4  鹅肥肝和鹅肝酱中维生素A 的含量及精密度实验

对同一样品进行重复5次测定,结果见表2。从变异系数看,具有良好的重现性,精密度符合要求。

表2 维生素A含量检测表及精密度检测

测量次数

1

2

3

4

5

M

SD

CV

鹅肥肝VA含量(IU/g)

17.24

17.08

17.22

17.18

17.08

17.16

±0.076

0.44%

鹅肝酱VA含量(IU/g)

3.43

3.43

3.48

3.37

3.44

3.43

±0.039

1.14%

 

5.5  回收率实验

采用鹅肥肝作为本实验的本底样品,添加一定量的标准样品,测定回收率,结果见表3。实验发现,VA的平均回收率为98.21%,说明该法具有较好回收率。

表3 鹅肥肝维生素A回收率的测定

组别

1

2

3

4

5

样品中维生素A含量(μg/100mg)

0.52

0.52

0.52

0.52

0.52

维生素A的添加量(mg)

0.6

0.6

0.6

0.6

0.6

回收测定量(mg/100mg)

1.08

1.09

1.13

1.11

1.09

回收率(%)

96.43

97.32

100.89

99.11

97.32

M平均回收率(%)

98.21

    

SD(%)

±1.79

    

CV

1.82%

    

 

6.小结

实验通过比较3种不同处理方法,确定了肝类物质中VA的HPLC检测方法;实验同时对鹅肥肝和鹅肝酱中的维生素A进行了检测,试验结果精密度较高,所采用的方法平均回收率达到98.21%,是较为准确可靠的结果。

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