维生素A是人体所必须的营养素之一，维生素A具有很大生理功能作用。VA进入机体后排泄效率不高，长期过量摄入可在体内蓄积，引起VA过多症。成年人长期每天摄入15000μg视黄醇当量，即可出现中毒症状，主要症状为厌食、过度激惹、恶心、呕吐、眼底水肿。*，肝中维生素A含量比较高，但对鹅肥肝检测方面的研究较少，本研究在前人检测维生素A的基础上，通过比较不同维生素A前处理方法，利用液相色谱法检测其含量。zui后选定*处理方法，该方法简单、快速、准确，适合肝类物质中的维生素A的检测。
1．化学试剂
石油醚（分析纯），**（分析纯），正己烷（色谱纯)，异丙醇（分析纯），无水硫酸钠（分析纯)，甲醇（色谱纯），乙醇（分析纯），氮气（分析纯），氢氧化钾（分析纯），抗坏血酸（分析纯），BHT（分析纯），维生素A标样（Singma）
2．仪器
HPLC（LabAlliance），M440型紫外检测器，旋转蒸发器，超声波，离心机，磁力搅拌器等
色谱柱：C18（250mm×4.6mm）5μ
检测器波长：325nm
维生素A标样浓度：12.3IU/mL（处理方法同样品）
3.处理方法
分别用三种方法处理样品，比较方法优劣。
3.1实验方法1
样品处理：称取10.0g均匀样品，置于100ml具塞试管中，加适量40℃热水溶解，摇振10min，加入15ml无水乙醇，1.0g抗坏血酸，摇振防结块，再加入10ml皂化液（50%KOH），在75℃水浴中皂化30min，并不时摇动。迅速冷却至室温，准确加入25.0ml萃取液（**：石油醚=1：1，V：V），振荡3min，再加入25ml蒸馏水，加塞，将试管倒转反复10次，用转速3000r/min离心管理新10min，仔细吸取上层有机相20.0ml与小试管中，通氮气浓缩至干，准确加入5.0ml甲醇，摇匀待测[7][8]。
检测器波长：325nm，流动相甲醇，进样量10μL，流速1.0mL/min。
3.2 实验方法2
样品处理：称取10.0g左右样品于研钵中，加适量甲醇，BHT及石英砂研磨，转移至皂化瓶中，加60mL乙醇，40mL50%KOH甲醇溶液，1.0mgBHT，60-75℃回流造化皂化40min。冷却后用正己烷反复提取皂化液，多次水洗至中性后，用无水硫酸钠脱水并定容至50mL5容量瓶中。取上述提取液5mL减压蒸干，用1mL甲醇溶解，经0.45μm滤膜待进样[9][10]。
检测器波长：325nm，流动相为正己烷：甲醇（87：13），进样量10μL，流速1.0mL/min。
3.3 实验方法3
样品处理：样品加入50%KOH氢氧化钾皂化，用乙迷提取，合并三次醚相，从乙迷提取液中分取10mL用氮气吹至近干，残渣用甲醇定容至10mL，过0.45μm滤膜待进样[11][12]。
检测器波长：325nm，流动相为100%甲醇，进样量10μL，流速1.0mL/min。
4．定量分析
定量方法为外标法；色谱条件为HPLC分析法。仪器平衡30min后，将一定量的表扬和样品分别进样，然后得出VA的标样及样品的峰面积。
5．结果与分析
5.1 不同处理方法所得HPLC图
将鹅肝按照方法1进行维生素A皂化，zui后将处理好的样品进行HPLC检测，结果如图1所示：
将鹅肝按照方法2进行维生素A皂化，zui后将处理好的样品进行HPLC检测，结果如图2所示：
将鹅肝按照方法3进行维生素A皂化，zui后将处理好的样品进行HPLC检测，结果如图3所示：
通过比较三种检测方法，其中方法3检测效果明显较好，故确定方法3为zui终实验方法。以下是利用方法3进行鹅肥肝和鹅肝酱VA的检测结果。
5.2 标准样品、鹅肥肝及鹅肝酱中维生素A检测的HPLC图
将标准样品、鹅肥肝及鹅肝酱按照方法3进行处理，进样分析，所得图谱如图4、图5、图6所示：
5.3 标准曲线与线性关系
分别配制不同浓度的5个标样，并将表扬依次进行分析，所得结果如下表：
表1 VA标样分析
编号 | VA标样的浓度/（IU/mL） | VA峰面积 |
1 | 10 | 231.26 |
2 | 20 | 497.45 |
3 | 30 | 743.78 |
4 | 40 | 965.14 |
5 | 50 | 1178.31 |
回归方程为y=236.18x＋14.651相关系数为0.9978，由此说明此线性关系良好。zui低检出限：如进样量为10μL，则zui低检出限VA为1.2×10-9g。
5.4 鹅肥肝和鹅肝酱中维生素A 的含量及精密度实验
对同一样品进行重复5次测定，结果见表2。从变异系数看，具有良好的重现性，精密度符合要求。
表2 维生素A含量检测表及精密度检测
测量次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | M | SD | CV |
鹅肥肝VA含量（IU/g） | 17.24 | 17.08 | 17.22 | 17.18 | 17.08 | 17.16 | ±0.076 | 0.44% |
鹅肝酱VA含量（IU/g） | 3.43 | 3.43 | 3.48 | 3.37 | 3.44 | 3.43 | ±0.039 | 1.14% |
5.5 回收率实验
采用鹅肥肝作为本实验的本底样品，添加一定量的标准样品，测定回收率，结果见表3。实验发现，VA的平均回收率为98.21%，说明该法具有较好回收率。
表3 鹅肥肝维生素A回收率的测定
组别 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
样品中维生素A含量（μg/100mg) | 0.52 | 0.52 | 0.52 | 0.52 | 0.52 |
维生素A的添加量（mg） | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 |
回收测定量（mg/100mg） | 1.08 | 1.09 | 1.13 | 1.11 | 1.09 |
回收率（％） | 96.43 | 97.32 | 100.89 | 99.11 | 97.32 |
M平均回收率（%） | 98.21 | ||||
SD（%） | ±1.79 | ||||
CV | 1.82% |
6.小结
实验通过比较3种不同处理方法，确定了肝类物质中VA的HPLC检测方法；实验同时对鹅肥肝和鹅肝酱中的维生素A进行了检测，试验结果精密度较高，所采用的方法平均回收率达到98.21%，是较为准确可靠的结果。
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