安捷伦液相色谱仪HPLC测定石杉碱甲的含量

石杉碱甲是石杉科植物中提取的一种生物碱，是一强效的胆碱酯酶可逆性抑制剂，其作用特点与新斯的明相似，但作用维持时间比后者为长。对真性胆碱酯酶具有选择性的抑制，抑制强度是假性胆碱酯酶的数千倍；抑制方式为竞争性和非竞争性的混合型抑制，与单纯竞争性抑制剂有显著不同；易通过血脑屏障进入中枢，兼具有中枢及外周治疗作用；有效时间长；从胃肠道吸收良好；安全指数大；稳定性好。

由于蕨类植物生长缓慢，繁殖困难，造成了石杉碱甲的原料药价格昂贵，因此，建立一个石杉碱甲含量的快速检测方法很有必要。为了科学、合理地利用石杉属植物资源，采用HPLC法对石杉中石杉碱甲的含量进行测定，为寻找和筛选石杉碱甲新的植物资源提供科学依据。

1、仪器与试药

安捷伦液相色谱仪(带四元泵，自动进样器，紫外检测器等);梅特勒天平;KQ50B超声清洗器;电热恒温水浴锅;石杉碱甲对照品(100243-200401);乙腈(色谱纯);二次重蒸水;其他试剂均为分析纯。

 实验药材采至贵州黔东南，由贵州科学院生物研究所王培善教授鉴定为昆明石杉，标本存放于贵阳中医学院民族医药研究所，标本凭证(20056)。

          昆明石杉

2、方法与结果（安捷伦液相色谱仪）

2.1色谱条件

ZORBAXSB-C18色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)，流动相0.02mol·L-1磷酸二氢钾-乙腈 (92∶8)，检测波长为310nm，流速1ml·min-1，柱温25℃，进样量为5μl。在此色谱条件下，样品中的石杉碱甲与其他峰能达到基线分离， 其理论塔板数为4656，对称因子为0.92。石杉碱甲的保留时间为11.15min，对照品与样品的色谱图见图1。

2.2样品的制备

 精密称取实验药材细粉2g于500ml的圆底烧瓶中，每次加入200ml石油醚提取3次，弃去滤液。滤渣再用95%的甲醇提取3次，合并滤液并 回收溶剂，加入2%的酒石酸溶解，用氨水调节pH值至8.0，再用氯方萃取至Dragendorffors反应呈阴性，挥干有机溶剂，用无水乙醇溶解并定 容至25ml即得。

2.3线性关系的考察

 精密称取石杉碱甲对照品2.40mg于25ml容量瓶中以无水乙醇溶解并定容，得浓度为0.096mg·ml-1对照品溶液，再分别稀释成 0.096，0.048，0.024，0.012，0.006，0.003mg·ml-1的对照品供试液，在色谱条件下测定。以进样浓度对峰面积进行回 归，得方程：Y=6776.0151X1.0305，r=0.99995。可知石杉碱甲在0.015～0.48μg之间与峰面积呈良好线性关系。

2.4精密度实验

取石杉碱甲对照溶液，在色谱条件下重复进样6次，结果石杉碱甲峰面积的RSD为0.36%(n=6)。

2.5稳定性实验

取供试品溶液，每隔2h测定1次，考察石杉碱甲的含量变化，结果含量的RSD为0.85%(n=6)，表明供试品在10h内稳定。

2.6重复性实验

精密称样品6份，按“2.2”项的要求制备6份供试液，在色谱条件下分别进行测定，结果Hup-A含量的RSD为0.60%(n=6)。

2.7回收率实验

精密称取昆明石杉药材细粉6份，每份1g，分别加入对照品供试液(0.003mg·ml-1)100ml，按样品制备方法和色 谱条件，制备加样回收供试液进行测定，计算回收率(见表1)。结果石杉碱甲的平均回收率为99.63%，RSD=0.56%(n=6)。表1石杉碱甲加样 回收率实验结果(略)

2.8样品的测定

 按“2.2”项的要求精密称取样品3份，制备供试液，按色谱条件进行测定，重复3次，取平均值，石杉碱甲在原植物中的平均含量为0.03%。

3、讨论（安捷伦液相色谱仪）

我们建立了用HPLC反相柱从石杉总碱中直接测定石杉碱甲的方法，该方法线性与精密度良好，平均回收率为99.89%，平均RSD为0.40%。实验证明该方法易行、灵敏、准确、可靠。在生产石杉碱甲的工作中得到了证实。  

安捷伦液相色谱仪测定方法是在其它石杉中石杉碱甲含量测定方法的基础上，改用ZORBAXSB-C18色谱柱及以0.02mol·L-1磷酸二氢钾-乙腈(92∶8)为流动相。

从石杉碱甲原植物中提取总生物碱，是一个常规和稳定的方法。通过测定总碱中石杉碱甲的含量，便可以推算出原植物中石杉碱甲的含量。该方法已经成为检定原植物的方法并应用于工作中。