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高校液相色谱法检测原料乳与乳制品中三聚氰胺
更新时间:2017-11-13   点击次数:1840次

三聚氰胺(英文:Melamine)(化学式:C3H6N6),俗称密胺、蛋白精,IUPAC命名为“1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺”,是一种三嗪类含氮杂环有机化合物,被用作化工原料。它是白色单斜晶体,几乎无味,微溶于水(3.1g/L常温),可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等,不溶于丙酮、醚类、对身体有害,不可用于食品加工或食品添加物。

一、原理

试样用三氯乙酸溶液-乙腈提取,经阳离子交换固相萃取柱净化后,用液相色谱测定,外标法定量。

二、试剂与材料

除非另有说明,所有试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。

a)   甲醇:色谱纯;

b)   乙腈:色谱纯;

c)   氨水:含量为25%~28%

d)   三氯乙酸;

e)   柠檬酸;

f)   辛烷磺酸钠:色谱纯;

g)   甲醇水溶液:准确量取50mL甲醇和50mL水,混匀后备用;

h)   三氯乙酸溶液(1%):准确称取10g三氯乙酸于1L容量瓶中,用水溶解并定容至刻度,混匀后备用;

i)   氨化甲醇溶液(5%):准确量取5mL氨水和95mL甲醇,混匀后备用;

j)   离子对试剂缓冲液:准确称取2.10g柠檬酸和2.16g辛烷磺酸钠,加入约980

mL水溶解,调节pH至3.0后,定容至1L备用;

k)   三聚氰胺标准品:CAS108-78-01,纯度大于99.0%;

l) 三聚氰胺标准储备液:准确称取100mg(到0.1mg)三聚氰胺标准品于100mL容量瓶中,用甲醇水溶液(3.2.7)溶解并定容至刻度,配制成浓度为1mg/mL的标准储备液,于4℃避光保存;

m)  阳离子交换固相萃取柱:混合型阳离子交换固相萃取柱,基质为苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物,60mg,3mL,或相当者。使用前依次用3mL

n)   甲醇、5mL水活化;

o)   定性滤纸;

p)海砂:化学纯,粒度0.65mm~0.85mm,二氧化硅(SiO2)含量为99%;

q)   微孔滤膜:0.2µm,有机相;

r)   氮气:纯度大于等于99.999%;

三、仪器和设备

液相色谱仪:配有紫外检测器或二极管阵列检测器;

分析天平:感量为0.0001g和0.01g;

离心机:转速不低于4000r/min;

超声波水浴;

固相萃取装置;

氮气吹干仪;

涡旋混合器;

具塞塑料离心管:50mL;

研钵;

四、样品处理

1.提取液态奶、奶粉、酸奶、冰淇淋和奶糖等:

称取2g(至0.01g)试样于50mL具塞塑料离心管中,加入15mL三氯乙酸溶液和5mL超声提取10min,再振荡提取

10min后,以不低于4000r/min离心10min。上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后,用三氯乙酸溶液定容至25mL,移取5mL滤液,加入5mL水混匀后做待净化液。

2.奶酪、奶油和巧克力等:

称取2g(至0.01g)试样于研钵中,加入适量海砂(试样质量的4倍~6倍)研磨成干粉状,转移至50mL具塞塑料离心管中,用15mL三氯乙酸溶液分数次清洗研钵,清洗液转入离心管中,再往离心管中加入5mL乙腈,余下操作同1.中“超声提取10min,……加入5mL水混匀后做待净化液”。

注:若样品中脂肪含量较高,可以用三氯乙酸溶液饱和的正己烷液液分配除脂后再用SPE柱净化。

2、净化

将1中的待净化液转移至固相萃取柱(m)中。依次用3mL水和3mL甲醇洗涤,抽至近干后,用6mL氨化甲醇溶液(i)洗脱。整个固相萃取过程流速不超过1mL/min。洗脱液于50℃下用氮气吹干,残留物(相当于0.4g样品)用1mL流动相定容,涡旋混合1min,过微孔膜(q)后,供HPLC测定。

五、液相色谱测定

5.1HPLC参考条件

a)色谱柱:C8柱,250mm×4.6mm(i.d.),5μm,或相当者;C18柱,250mm×4.6mm(i.d.),5μm,或相当者。

b)流动相:C8柱,离子对试剂缓冲液(j)-乙腈(85+15,体积比),混匀C18柱,离子对试剂缓冲液(j)-乙腈(90+10,体积比),混匀。

c)流速:1.0mL/min。

d)柱温:40℃。

e)波长:240nm。

f)进样量:20μL。

5.2标准曲线的绘制

用流动相将三聚氰胺标准储备液逐级稀释得到的浓度为0.8、2、20、40、80μg/mL的标准工作液,浓度由低到高进样检测,以峰面积-浓度作图,得到标准曲线回归方程。基质匹配加标三聚氰胺的样品HPLC色谱图如下。

5.3定量测定

待测样液中三聚氰胺的响应值应在标准曲线线性范围内,超过线性范围则应稀释后再进样分析。

5.4结果计算

试样中三聚氰胺的含量由色谱数据处理软件或按式(1)计算获得:

5.5空白实验

除不称取样品外,均按上述测定条件和步骤进行。

5.6方法定量限

本方法的定量限为2mg/kg。

5.7回收率

回收率在添加浓度2mg/kg~10mg/kg浓度范围内,回收率在80%~110%之间,相对标准偏差小于10%。

5.8允许差

在重复性条件下获得的两次立测定结果的差值不得超过算术平均值的10%。

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