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液相色谱仪HPLC 测定胆酸和猪去氧胆酸的含量
更新时间:2016-01-05   点击次数:3681次

1 仪器与试药

HPLC液相色谱仪; SPD-UV 检测器。胆酸对照品( 批号100078-200414) 、猪去氧胆酸对照品( 批号100087-200610; 标示纯度为:97. 3%) 均由中国药品生物制品检定所提供; 胆酸、猪去氧胆酸各10 批; 乙腈为色谱纯; 其余试剂均为分析纯。2 方法与结果

2. 1 色谱条件

色谱柱: Diamonsil-C18( 4. 6 mm × 150 mm,5μm) ; 流动相: 乙腈-水-磷酸( 35 ∶ 65 ∶ 0. 1) ; 检测波长: 192 nm; 柱温: 25 ℃; 流速: 1. 5 mL·min - 1。色谱图见图1。

 

图1 HPLC 图谱

A. 胆酸对照品; B. 猪去氧胆酸对照品; C. 胆酸供试品; D. 猪去氧胆酸供试品

 

2. 2 溶液制备

2. 2. 1 对照品溶液制备

精密称取胆酸对照品15. 77 mg,置于10 mL 量瓶中,加60% 乙腈制成每1 mL含胆酸1. 577 mg 的对照品溶液; 再精密称取猪去氧胆酸对照品9. 90 mg,同法制成每1 mL 含猪去氧胆酸0. 963 3 mg 的对照品溶液,即得。

2. 2. 2 供试品溶液制备

精密称取胆酸、猪去氧胆酸各10 mg,分别置于10 mL 量瓶中,加60%乙腈使溶解并稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

2. 3 方法学考察

2. 3. 1 线性

分别精密量取胆酸和猪去氧胆酸对照品溶液各2,5, 10, 15, 20 μL,注入液相色谱仪,测定峰面积值。以胆酸和猪去氧胆酸各自的对照品进样量( μg) 和峰面积值进行回归处理,回归方程分别为,胆酸: y = 12 504x + 917. 37,r = 0. 999 5; 猪去氧胆酸: y = 7 995. 4x + 41. 437,r = 0. 999 2,胆酸的线性关系范围为: 3. 154 ~ 31. 540 μg; 猪去氧胆酸的线性关系范围为: 1. 927 ~ 19. 266 μg。

2. 3. 2 zui低检测限

分别取胆酸和猪去氧胆酸对照品溶液,用60%乙腈稀释30 倍,按上述色谱条件进样10 μL,测定信噪比( S /N) = 3,故胆酸、猪去氧胆酸的zui低检测限分别为0. 5 和0. 3 μg。

2. 3. 3 精密度

分别取胆酸和猪去氧胆酸对照品溶液,按上述色谱条件进样10( L,连续6 次。结果胆酸RSD 为0. 29%; 猪去氧胆酸RSD 为0. 65%。

2. 3. 4 重复性

取胆酸( 批号B1-09-05-02) 和猪去氧胆酸( 批号B2-09-05-01) 样品,照“2. 2. 2”项下方法制备供试品溶液,分别平行试验6 份,测定胆酸和猪去氧胆酸的含量。结果胆酸RSD 为0. 71%; 猪去氧胆酸RSD 为0. 81%。

2. 3. 5 稳定性

取胆酸( 批号B1-09-05-02) 和猪去氧胆酸( 批号B2-09-05-01) 样品,照“2. 2. 2”项下方法制备供试品溶液,分别在0,2,4,6,8 h 进样10μL,测定峰面积值。结果胆酸RSD 为0. 56%; 猪去氧胆酸RSD 为1. 4%。

2. 3. 6 加样回收率试验

精密称取胆酸供试品( 批号B1-09-05-02,含量: 83. 4%) 适量( 约相当于胆酸含量为10 mg) 、猪去氧胆酸供试品( 批号B2-09-05-01,含量为73. 0%) 适量( 约相当于猪去氧胆酸含量为8 mg) ,分别置于10 mL 量瓶中,加60%乙腈使溶解并稀释至刻度。再精密量取胆酸对照品溶液( 浓度为5. 006mg·mL - 1 ) 、猪去氧胆酸对照品溶液( 浓度为3. 988 mg·mL - 1 ) 各2 mL,分别加入上述胆酸、猪去氧胆酸供试品溶液中,混匀即得。分别平行试验6 份,测定含量。结果胆酸回收率为:98. 98%,RSD 为0. 42%; 猪去氧胆酸回收率为:98. 29%,RSD 为0. 61%,结果见表1,2。

2. 4 样品含量测定

取胆酸和猪去氧胆酸样品,照“2. 2. 2”项下方法制备供试品溶液,按上述色谱条件进样10( L,测定胆酸和猪去氧胆酸的含量。结果见表3,4。

3 讨论

胆酸现有药品标准系采用紫外分光光度法进行含量测定,猪去氧胆酸则是采用酸碱滴定法测定含量,以上两种方法存在操作繁琐、准确度差、专属性差等缺点,本文应用HPLC-UV 法检测胆酸及猪去氧胆酸含量,方法简便、准确,可以实现对两种成分的快速定量分析。文中供试品的制备方法及色谱条件主要参照《中国药典》2005年版一部“清开灵注射液”项下胆酸的含量测定方法。

胆酸和猪去氧胆酸均为紫外末端吸收( 192nm) ,灵敏度方面较蒸发光散射检测器稍为逊色,但考虑到HPLC-ELSD 仪器较昂贵,适用性不强,因此在常规质量分析中,HPLC-UV 法更为实用。

胆酸的含量范围按标准不得少于80. 0%,通过以上10 批样品的检测结果可以看出,本标准适用于液相色谱法; 而猪去氧胆酸标准含量为不得少于98. 0%( 酸碱滴定法) ,由于酸碱滴定法所检测成分的专属性差,能与NaOH 发生反应的酸性物质均会被检测出来,因此应用液相色谱法测定猪去氧胆酸含量通常远远低于滴定法,根据以上对10 批样品的实际检测情况,可拟订猪去氧胆酸含量范围为: 本品按干燥品计算,含猪去氧胆酸( C24H40O4) 不得少于70. 0%。以上标准可以作为胆酸及猪去氧胆酸的质量控制标准。

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