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液相色谱仪HPLC测定食品中的罗丹明B
更新时间:2016-01-05   点击次数:3002次

1 材料与方法

1. 1 主要仪器

液相色谱仪HPLC( 配有四元梯度泵、紫外/可见光检测器) ,超声波振荡器,固相萃取装置,离心机,氮吹仪,振荡器。

1. 2 试剂

甲醇( MERCK 色谱纯) ,罗丹明B( AR,天津光复精细化工研究所) ,正己烷( AR)

1. 3 色谱条件

Acclaim 120 C18柱( 5 μm,4. 6 mm × 250 mm) ; 进样量:20 μl; 流动相: 甲醇+ 水( 75 + 25) ,流速1. 0 ml /min;检测波长: 550 nm。

1. 4 标准曲线

标准物( 罗丹明B) 用75% 甲醇配制成1 mg /ml,再用75% 甲醇稀释成0. 1 μg /ml,0. 5 μg /ml,1. 0 μg /ml,5. 0μg /ml, 10. 0 μg /ml 标准系列。

1. 5 样品前处理

1. 5. 1 提取

1. 5. 1. 1 辣椒粉,调味品,水制辣椒酱: 5 g 样品,加5 ml 甲醇,振荡器振荡2 min,超声10 min, 4000 r /min 离心10 min,取上清液备用。

1. 5. 1. 2 油制辣椒酱,肉类: 5 g 样品,加5 ml 甲醇,振荡器振荡2 min,超声10 min,加正己烷5 ml,振荡器振荡2 min,4000 r /min离心10 min,取醇层备用。

1. 5. 2 净化

Sep - pak C18小柱用3 ml 甲醇活化,5ml 水平衡,吸提取液2. 5 ml 加2. 5 ml 水注入固相萃取小柱,控制流速5 ml /min ~ 8 ml /min,依次用5 ml 水、5 ml 50% 甲醇淋洗。再用75%甲醇洗脱,收集洗脱液。

1. 5. 3 浓缩

洗脱液置50℃ 水浴,氮吹仪吹干,用1. 0 ml75%甲醇溶解残渣,过0. 45 μm 滤膜,供液相色谱测定。

2 结果与讨论

2. 1 波长选择

罗丹明B 的75%甲醇溶液于紫外/可见分光光度计扫描,测得该溶液在550 nm 有zui大吸收,选择550 nm 作为测定波长,既可以保证有zui高灵敏度,也可以排除许多无颜色有机物的干扰。

2. 2 流动相选择

选择液相色谱zui为普通的甲醇、水作为流动相,既避免了接触毒性较大乙腈,又减少其它溶液配制步骤,但流动相中甲醇比例太低时,罗丹明B 很难洗脱出来,100% 甲醇又比较快就洗脱出来,选择75%甲醇作为该方法的流动性,既可以保证罗丹明B 在适当时间( 保留时间8. 6 min) 内洗脱出来,又可以与大部分干扰物质分离。

2. 3 方法线性范围与检出限

标准系列各进样20 μl,得到其色谱图( 见图3) ,以标准液浓度为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线; 其线性回归方程为Y = 0. 3282 + 5. 2339X,相关系数为0. 9994。该方法在0. 1 μg /ml ~ 10 μg /ml 的线性良好,检出限0. 02 μg /ml,定量下限0. 05 μg /ml。样品进样20 μl,得到其色谱图( 见图1,2) ,其峰面积在标准曲线上查得其对应的含量,或者将其峰面积代入线性回归方程得到其对应的含量。按上述步骤操作,样品检测限低至0. 008 mg /kg。

2. 4 方法回收率与精密度

在样品中加入高、中、低三个不同量的标准,使每一浓度分别进行6 次重复测定,回收率,精密度见表1。

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该方法回收率在96. 1% ~ 100. 4%,相对标准偏差RSD( %) 在1. 8% ~ 3. 9%,说明方法的精密度和准确度良好。

2. 5 方法干扰试验

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图1,图2 分别是罗丹明B 阴性,阳性样品,由于选择的波长为550 nm,落在可见光区,食品中许多无颜色的有机物在该波长下均未吸收或吸收很小,可以忽略不计,所以基线很平滑,干扰物质很少; 图3 是罗丹明B 标准物色谱图; 图4 是含有罗丹明B,胭脂红,苋菜红,诱惑红,赤鲜红,苏丹红Ⅰ,苏丹红Ⅱ,苏丹红Ⅲ,苏丹红Ⅳ各5 μg /ml 溶液的色谱图,由图3,图4可以看出在该色谱条件下常见的水溶性红色色素胭脂红,苋菜红,诱惑红,赤鲜红和常见的脂溶性红色色素苏丹红Ⅰ,苏丹红Ⅱ,苏丹红Ⅲ,苏丹红Ⅳ均未对罗丹明B 检测造成干扰。

3 结论

本方法*国家标准空白,由于液相色谱- 紫外/可见检测器比较普及,适合于基层单位罗丹明B 检验,为打击“食品中可能违法添加的非食用物质”提供有力依据。本方法操作简单,由于选择波长为550 nm,在可见光波段,干扰少,选择性好,灵敏度高,准确度和精密度都很好。

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