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液相色谱法测定忍冬中7种成分
更新时间:2016-01-04   点击次数:1678次

忍冬的花和藤均为药用部位,并被中华人民共和国药典所收载而忍冬的叶子被视为金银花和忍冬藤的副产物,产量虽然较高,却一直被视为非药用部位而未得到充分开发利用,造成资源浪费为此,本文进一步研究了金银花忍冬新叶及忍冬老叶之间成分含量的差异,为忍冬叶药用价值的开发提供参考

1实验部分

11仪器与试剂

液相色谱仪(Agilent1220,包括四元泵及VWD紫外检测器;Agilent公司) ;超声波清洗机

对照品:绿原酸(质检编号:PS08072303)咖啡酸(质检编号:PS08092501)木犀草苷(质检编号:PS10052501) 绿  A(   :PS100623-01)异绿原酸B(质检编号:PS100623-02)异绿原酸C(质检编号:PS100623-03) ,纯度均大于98%,由成都普思生物科技有限公司提供乙腈为色谱纯(Fisher公司) ;甲酸为分析纯(国药集团化学试剂公司) ;超纯水由Milli-Q系统制备   冬老叶忍冬新叶均采自河南省邢台市巨鹿县

12对照品溶液的制备

分别称取绿原酸异绿原酸A异绿原酸B异绿原酸C对照品10mg,用50%(v/v,下同)甲醇水溶液1.5mL溶解并定容;咖啡酸芦丁木犀草素对照品10mg,用50%甲醇水溶液10mL溶解并定容;将溶解液过0.45μm有机滤膜,得对照品溶液

13供试品溶液的制备

称取样品粉末(60°C烘干24h,磨碎过40目筛)0.5g,加入50%甲醇水溶液10mL,称定质量;超声提取1h,放冷,再称定质量,并用50%甲醇水溶液补足质量;摇匀,过滤,取滤液过0.45μm的有机滤膜,滤液供液相色谱测定

14液相色谱条件色

谱柱:AgilentEclipsePlusC18(250mm×4.6mm5μm) ;柱温:20°C;进样量:10μL流动相:0.3%甲酸水溶液(A)和乙腈(B)洗脱程序:025min8%B;2530min8%B19%B;3060min19%B流速:1mL/min检测波长切换程序:030min330nm;3040min350nm;4060min330nm

2结果与讨论

21实验条件的优化

为了使供试品溶液获得*的提取率,采用50%甲醇水溶液对样品进行超声提取;将超声时间设定为1h,以达到充分提取的效果由于绿原酸咖啡酸芦丁木犀草素异绿原酸的zui大吸收波长不一致,如绿原酸在350nm处的吸收值是330nm处吸收值的一半,木犀草苷在330nm处的吸收值约比350nm处的吸收值低20%为了提高方法的灵敏度,保证绿原酸和木犀草苷等目标化合物都能在各自zui大吸收波长下检测,本文采用了带有检测波长转换程序的测定方法由于绿原酸咖啡酸及异绿原酸的检测波长为330nm,芦 木犀草苷的检测波长为350nm,本文优化得到了1.4节所述的检测波长切换程序

22方法学的考察

221线性关系

取绿原酸咖啡酸芦丁木犀草苷异绿原酸A异绿原酸B异绿原酸C对照品溶液适量混合,得到一定浓度的混合标准品溶液,进而稀释得到不同梯度浓度的混合标准品溶液取上述不同梯度浓度的混合标准品溶液10μL进样分析,以峰面积Y为纵坐标,进样质量浓度X(mg/L)为横坐标绘制标准曲线,结果见表1

222精密度重现性和稳定性

准确吸取绿原酸咖啡酸芦丁木犀草苷异绿原酸A异绿原酸B异绿原酸C对照品混合溶液10μL,按照1.4节建立的方法进行检测,重复测定5次,记录峰面积,计算各个化合物的相对标准偏差(RSD)均小于3%(见表2) ,表明仪器精密度良好

精密称取同一批金银花样品粉末0.5g,共5份,按照1.3节方法制备供试品溶液,再按照1.4节建立的方法进行检测,记录峰面积,计算得到各化合物峰面积的RSD1.68%3.15%(见表2) ,表明方法的重现性良好

另精密称取金银花样品0.5g,按照上述方法制备供试品溶液,分别于室温下放置024681012h后进行检测,计算得到各化合物峰面积的RSD均小于3%(见表2) ,表明供试品溶液在12h内稳定性良好

 

 

223加标回收率

精密称取同一批金银花样品粉末5份,每 0.5g,向已知含量的样品中加入混合标准品,按照以上方法制备供试品溶液,分别进样10μL,按照以上色谱条件进行HPLC测定,记录峰面积,计算各个成分的回收率(见表3)

 

 

23样品含量的测定

采用上述建立的分析方法,对金银花样品进行测定4结果表明,金银花不同部位的有效成分含量存在差异对于中华人民共和国药典中规定的绿原酸木犀草苷两种有效成分,金银花忍冬老叶忍冬新叶三者中含量差异显著新叶中绿原酸含量为2.572%,大于中国药典中规定的1.5%;木犀草苷含量为1.498‰,远远大于中国药典中规定的0.5‰除此之外,作为金银花有效成分的黄酮类物质芦丁,其在忍冬新叶中的含量为1.845‰,比在金银花中的含量1.261‰46.31%   叶中除咖啡酸木犀草苷含量与金银花中的含量差异不显著外,其他各种有效成分含量均低于金银花中的含量忍冬不同部位有效成分总含量高低顺序为:金银花>忍冬新叶>忍冬老叶,差异显著,但忍冬新叶总含量仅比金银花低6.92%,总含量成分接近,因此忍冬新叶有进一步研究和开发的必要1为金银花忍冬老叶忍冬新叶和混合标准品溶液的色谱图

 

 

3结论

本文建立了同时测定忍冬中7种有效成分的液相色谱方法该方法具有操作简单,精密度重复性稳定性及回收率高等特点应用该检测方法,发现忍冬新叶中绿原酸木犀草苷含量均超过了中华人民共和国药典    平,分 2.572%1.498‰,且7种目标成分的总含量仅比金银花低6.92%,证明忍冬叶中也含有大量的功能成分,有必要对忍冬叶进行深入的研究和开发本文为更好的评价忍冬品质提供了更有效的方法

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