双 氰 胺（ｄｉｃｙａｎｄｉａｍｉｄｅ，ＤＣＤ）又 称 二 氰 二 胺，分子式 为Ｃ２Ｎ４Ｈ４。双 氰 胺 是 一 种 白色 结 晶 粉 末，可溶于水，是一种重要的有机化工原料，可用于生产三 聚 氰 胺，在 医 药 工 业 中 也 可 以 用 于 制 取硝 酸 胍和 磺 胺 类 药 物，还 可 以 用 于 固 色 剂、黏 合 剂 等，农业上用于对肥料的凝固作用，防止肥料流失，对肥料中的硝酸盐类（如硝酸钾）、胺类化合物进行中和，减少该类化学物质的有害作用。双氰胺对人 体 是否有害以及含量多少会对人体产生危害目前尚没有明确的研究结 论，还需要进行毒理研究。但 双 氰 胺是含氮量高且性 质 较 稳 定 的 非 蛋 白 氮 物质，少 量 加入不影响食品风 味；由 于 目 前 国 家 标 准 规 定 的 蛋 白质测定方法基于 凯 氏 定 氮 法，样品中任何含氮物质均折算成蛋白质含量，因此很可能被不法商家利用，非法添加到食品中。

本文建立了乳制品中双氰胺的液相色谱－紫外检测法，优化 了 前 处 理 方 法 和 高 效液 相 色 谱 条 件。该 方法 简 便、快 速、有 效，适 用 于 乳制品中双氰胺的检测。

一、实验部分

１．１仪器、设备和试剂

Ａｇｉｌｅｎｔ１２６０高 效 液 相 色 谱 仪（配 二 极 管 阵 列检测器）；乙 腈、甲 酸（色 谱 纯，Ｍｅｒｃｋ公司）；试 验 用水为Ｍｉｌｌｉ－Ｑ超 纯 水。标 准 物 质：双 氰 胺（纯 度９９．４％，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ公司）。

双 氰 胺 标 准 溶 液 的 配 制：准 确 称 取１００ｍｇ双氰胺标准品于１００ｍＬ容量 瓶 中，用 水 溶 解，配 制 成１．０ｇ／Ｌ的储备液。用流动相 将 标 准 储 备 液 稀 释 成０．５、１．０、２．０、５．０、１０．０、２０．０、５０．０ｍｇ／Ｌ的系列标准溶液。

１．２色谱条件

液相色谱 柱：ＸＢｒｉｄｇｅＡｍｉｄｅ柱（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ，３．５μｍ，Ｗａｔｅｒｓ公 司）；柱 温：３５°C；进 样 量：２０μＬ；流动相：乙 腈－水（体 积 比 为９０∶１０）（含 体 积分数为０．２％的 甲 酸）；流 速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ；检 测 波长：２１８ｎｍ。

１．３样品前处理

称取固态、半固态样品（奶粉、炼 乳 等）１ｇ（精 确到０．０１ｇ）或 液 态 样 品（纯 奶、酸 奶 等）２ｇ（精 确到０．０１ｇ），置于１０．０ｍＬ比色管中，固态、半固态样品加入３ｍＬ７０°C热水，液态样品加 入１ｍＬ７０°C热水 充分涡旋２ｍｉｎ，置于７０°C热水浴中１５ｍｉｎ充分溶解提取，冷却至 室 温，涡 旋 中 分３次 加 入 乙 腈，每次加入２ｍＬ，zui后用乙腈定容至１０．０ｍＬ，涡 旋 摇匀，取２ｍＬ液体至２ｍＬ离 心 管 中，以８０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取１．０ｍＬ上 清 液 于５０°C下 氮 气 吹干，用１．０ｍＬ流 动 相 溶 解，过０．４５μｍ滤 膜，滤 液供ＨＰＬＣ分析。

二、结果与讨论

２．１色谱条件的优化对双氰 胺 标 准 溶 液 进 行 光 谱 扫 描，发 现 在２１８ｎｍ处有zui大吸收，确定其检测波长为２１８ｎｍ。

双 氰 胺 在Ｃ１８柱 上 几 乎 无 保 留。双 氰 胺 的 性质和三聚氰胺类 似，因 此 试 图 采 用 与 三 聚 氰 胺 检测相同的多种离子对试剂如庚烷磺酸钠等作为流动相，但是没有达 到 预 期 效 果。基于双氰胺的性质，采 用 了ＸＢｒｉｄｇｅＡｍｉｄｅ柱 作 为 分 离 柱。选 择 不同比例的乙腈－水作为流动相，对 双 氰 胺 标 准 溶 液 进行测定，没有出现目标物色谱峰，加入少量甲酸后，得到相应的目标物色谱峰。通过实验zui终确定以含０．２％甲酸的乙腈－水（９０／１０，ｖ／ｖ）作 为 流 动 相 时，目标峰的峰形和保 留 时 间 zui 佳，并且目标峰的保留时间为５ｍｉｎ左 右，大大减少了基质对目标峰的干扰作用，优化条件下的标准溶液色谱图见图１。

２．２前处理方法的建立

乳制品基质 比 较 复 杂，对检测的主要干扰物为脂肪和蛋白质，因 此 除 去 脂 肪 和 蛋 白 质 的 干 扰 zui 为关键。综合考虑 采 用 有 机 试 剂 沉 淀 蛋 白 质，便 于 后续样品的处理。

直接用乙腈 进 行 定 容 后 涡 旋 超 声 提 取，发 现 回收效果不稳定，回收率差异较大，且乳制品中的蛋白质往往黏结成 块状。推 测 在 乙 腈 快 速 加 入 后，蛋 白质迅速黏结包夹了部分双氰胺。考察了缓慢加入乙腈对蛋白质沉淀和回收率的影响。结 果 表 明，在 涡旋条件下，缓慢加 入 乙 腈 能 有 效 地 防 止 蛋 白 质 迅 速黏结，蛋白质呈分散状态，回收率高且稳定。另外还考察了超声提取对回收率的影响，结果表明，在涡旋过程中缓慢加入乙腈后超声与否不影响提取效果。故本文采用在涡旋过程中缓慢加入乙腈的提取方式。

实验 发 现 将 上 述 提 取 液 过 微 孔 滤 膜 后 直 接 进样，样品色 谱 图 会 有 很 高 的 溶 剂 峰。取１．０ｍＬ提取液于５０°C下 氮 气 吹干，再 用１．０ｍＬ流 动 相 溶解，过滤膜，滤液供ＨＰＬＣ分 析，则 样 品 色 谱 图 中 的溶剂峰消失，因此，样品提 取 后 取１．０ｍＬ提 取 液 用氮气吹干，再用流动相重新溶解样品，供色谱检测。

２．３线性范围、检出限和定量限

对双氰胺的 标 准 溶 液 进 行 检 测，以 仪 器 响 应 的峰面积Ｙ对双氰胺的质量浓度Ｘ进行线性回 归，双氰胺在０．５～５０ｍｇ／Ｌ范 围 内 的 线 性 关 系 良 好，回归方程 为Ｙ＝１５３．８７Ｘ＋２１．５６，相 关 系 数（ｒ２）为０．９９９９。在空白样品处理液 中 添 加 双 氰 胺 标 准 品，以Ｓ／Ｎ＝３确定方法的检出限，以Ｓ／Ｎ＝１０确 定 方法的定量限，得到双氰胺的检出限为０．２ｍｇ／ｋｇ，定量限为０．５ｍｇ／ｋｇ。

２．４回收率和精密度

对乳粉（经确认不含双氰胺）样品进行回收率试验，添加水平分别为１．０、２．０和５．０ｍｇ／ｋｇ，采 用 优化后的前处理方 法 对 样 品 进 行 处 理，每 个 添 加 水 平重复６次，平 均 回 收 率 分 别 为１０１．０％、９６．７％和９９．７％，ＲＳＤ分别为４．８％、４．５％和４．９％（见表１）。

２．５实际样品测定

采用本方法对鲜奶、酸奶、炼乳、乳粉等４０批乳制品进行检测，结果均未检出双氰胺。

三、结论

利用液相色谱法对乳制品中的双氰 胺 进 行分 析，该方法优化了ＸＢｒｉｄｇｅＡｍｉｄｅ柱的分析条件，色谱峰保留 时 间 优 化 为５ｍｉｎ左 右，大 大 降 低 了 基质的干扰，方法简 单 快 速，准 确 度 和 精 密 度 高，适 用于各种乳制品中双氰胺的检测。采用乙腈作为沉淀剂能有效地沉淀蛋白质，消除蛋白质干扰，从而保障了该方法对乳制品中双氰胺分析的准确性。本方法适用于乳制品中双氰胺的分析和质量控制。