1 仪器与试药

日立公司氨基酸自动分析仪，型号为L － 8800 : 17 种L － 氨基酸混合标样( 0. 1 mol·L － 1 HCl 储备液) 由sigma 提供，不同pH 值和离子强度洗脱用缓冲溶液，茚三酮等( 按仪器说明书配制) 。Bruker 傅立叶变换离子回旋共振质谱，型号为IV FT －MS。Elite 液相色谱仪: Elite UV230Ⅱ检测器，Elite ZW Ⅱ柱温箱，Elite ES2600 工作站。焦谷氨酸含量为98%，由Alfa aesar 提供。山羊角及山羊角提取物( 批号: 091001)  乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 山羊角提取物中焦谷氨酸的确认

2. 1 氨基酸成分检测

2. 1. 1 样品的配置

山羊角水解液的制备：

取山羊角，制成粉末，精密称取约0. 5 g，置于安瓿瓶中，加入浓硫酸10 mL，氮气保护后，封口于100 ℃恒温酸水解12 h，取出水解液，用氢氧化na溶液调pH = 7，制成山羊角水解液。

山羊角提取物溶液的制备:

准确称取山羊角提取物约0. 5 g，溶入10 mL 水中，制成山羊角提取物溶液。取山羊角水解液及山羊角提取物溶液各1 mL，用0. 45 μm 滤膜过滤。并与氨基酸自动分析仪所用盐酸溶液等比例混合，供检测。

2. 1. 2 氨基酸自动分析

调整仪器参数及洗脱液pH，使各氨基酸分辨率≥85%，分别自动进样制备好的山羊角水解液和山羊角提取物溶液各20 μL 进行分析，其中缓冲溶液流速为0. 400 mL ·min － 1。茚三酮溶液为0. 350 mL ·min － 1。结果见图1。

2. 2 傅立叶变换离子回旋共振质谱

2. 2. 1 质谱条件

扫描方式为电喷雾负离子模式，扫描范围: 0 ～ 300 m/z，干燥气温度: 200 ℃，干燥气流量: 12 L ·min －1，雾化气流量: 6 L ·min － 1，电喷雾电压为2. 3 kV。注射泵进样速度2 μL ·min － 1。2. 2. 2 样品处理取微量山羊角提取物，溶于甲醇中，加入适量乙酸，促进其离子化。用0. 25 mL 注射器吸取一定体积样品液固定在注射泵上，直接进样。2. 2. 3 质谱结果见图2。

2. 3 焦谷氨酸的确定

从氨基酸自动分析仪上我们可以很清楚地看出，山羊角提取物与山羊角水解液的氨基酸有一定的差别，而谷氨酸含量zui多且差别较大( 见图1) 。根据分析认为1 种可能性是山羊角提取物中谷氨酰胺水解不*所导致，而谷氨酰胺在酸性环境下可转化为谷氨酸; 而另1 种可能性是谷氨酸在山羊角处理过程中转化为其他物质。但考虑到山羊角提取物为山羊角在过量硫酸中于106 ℃处理16h，水解较*，可以排除第1 种可能性; 而在山羊角提取物制取过程中有烘干步骤，且谷氨酸加热后易脱水转化为焦谷氨酸( 图3) 。为了验证上述的判断，对山羊角提取物进行高分辨质谱分析。结果发现了m/z 128. 03548 离子峰，其匹配*分子式为C5H6NO3，因其是ESI －模式下，主要的离子化反应是质子转换和电荷交换，因此可能形成M－。所以分子式应为C5H7NO3，符合焦谷氨酸的分子式，而m/z 146. 04642离子峰，其分子式应为C5H9NO4，确定其为谷氨酸，并且没有谷氨酰胺的分子峰出现。此后的液相分析也佐证了的判断，在相同时间，焦谷氨酸标准品与山羊角提取物供试品有同一时间峰。故可以肯定山羊角提取物中含有焦谷氨酸。

3 含量测定

3. 1 色谱条件

采用Sionchrom ODS － BP 色谱柱( 200 mm × 4. 6 mm，5 μm) ，以流速为1. 0 mL·min － 1，检测波长205 nm，柱温27℃。流动相: 乙腈－ 3. 5 mmol·L － 1 磷酸氢二钠缓冲液( 1∶ 99) ，用磷酸调pH = 3，上样20 μL。

3. 2 溶液的制备

3. 2. 1 对照品溶液

称取焦谷氨酸对照品适量，用流动相配成136 μg ·mL － 1的溶液。

3. 2. 2 供试品溶液

取山羊角提取物约1 g，精密称定，置于1 L 量瓶中，用流动相定容即可。

3. 3 线性关系考察

将对照品溶液等倍稀释为136， 68， 34， 17， 8. 5 μg ·mL － 1，按上述液相条件分别进样测定。以对照品量为( X)为横坐标，峰面积积分值( Y) 为纵坐标，得回归方程为:Y = 15. 08X + 28. 88 r = 0. 999线性范围8. 5 ～ 136 μg。

3. 4 精密度试验

取对照品溶液，在上述色谱条件下连续进样5 次，每次进样20 μL，测得焦谷氨酸色谱峰面积的分别为1098. 49，1101. 26，1089. 04，1106. 52， 1092. 27 mV。其RSD 为0. 64% ( n = 5) ，结果表明精密度良好。

3. 5 稳定性试验

取同一供试品溶液，在上述色谱条件下，分别于0，1，2，4，8，12， 24 h 各取20 μL 进样测定，峰面积分别为1127. 71，1121. 52，1117. 47，1119. 42， 1112. 5， 1104. 71， 1109. 55 mV，测得焦谷氨酸色谱峰峰面积的RSD 为0. 70% ( n = 7) ，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

3. 6 加样回收率试验

取批号为091001 的样品( 含量为7. 65%) 0. 01 g 各9 份，精密称量后，按3个水平加入“3. 2. 1”项下136 μg ·mL －1溶液1，2，5mL 各3 份，定容于10 mL 量瓶中，流动相定容，按上述色谱条件分别进样20 μL，计算回收率。低、中、高浓度回收率( n = 3 ) 分别为99. 8%，100. 1%，100. 0%; RSD 分别为0. 25%， 0. 18%，0. 03%。

3. 7 方法专属性试验

取焦谷氨酸标准品、谷氨酸、谷氨酰胺对照品各10. 0 mg，混合后用流动相定容于100 mL 量瓶中。按上述色谱条件取样20μL进样测定。结果显示谷氨酸、谷氨酰胺色谱峰的出峰时间均不同于焦谷氨酸出峰时间，对焦谷氨酸检测无干扰。结果见图4。

3. 8 检测限及定量限

将“3. 2. 1”项下对照品溶液依次稀释至不同浓度，按上述色谱条件分别取样20 μL 进样测定。按信噪比分别为3 和10 时进行检测限及定量限测定。焦谷氨酸的检测限及定量限分别约为0. 136 μg 和0. 425 μg。

3. 9 含量测定

吸取20 μL 供试品溶液，按照上述色谱条件进行测定，按照峰面积外标法，进样3 次，峰面积分别为1127. 71，1115. 25，1112. 14 mV。计算出第091001 批山羊角中焦谷氨酸的含量为7. 65%，RSD = 0. 74% ( n = 3)。结果见图5。

4 讨论

在山羊角提取物中发现的焦谷氨酸此前没有相应的检测标准，而本文所建立的液相色谱检测方法具有专属性强，检测方便，出峰时间快等特点，是一种适宜检测山羊角提取物中焦谷氨酸含量的方法。