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液相色谱仪测定山羊角提取物中焦谷氨酸含量
更新时间:2017-04-01   点击次数:1595次

1 仪器与试药

日立公司氨基酸自动分析仪,型号为L - 8800 : 17 种L - 氨基酸混合标样( 0. 1 mol·L - 1 HCl 储备液) 由sigma 提供,不同pH 值和离子强度洗脱用缓冲溶液,茚三酮等( 按仪器说明书配制) 。Bruker 傅立叶变换离子回旋共振质谱,型号为IV FT -MS。Elite 液相色谱仪: Elite UV230Ⅱ检测器,Elite ZW Ⅱ柱温箱,Elite ES2600 工作站。焦谷氨酸含量为98%,由Alfa aesar 提供。山羊角及山羊角提取物( 批号: 091001)  乙腈为色谱纯,其他试剂均为分析纯。

2 山羊角提取物中焦谷氨酸的确认

2. 1 氨基酸成分检测

2. 1. 1 样品的配置

山羊角水解液的制备:

取山羊角,制成粉末,精密称取约0. 5 g,置于安瓿瓶中,加入浓硫酸10 mL,氮气保护后,封口于100 ℃恒温酸水解12 h,取出水解液,用氢氧化na溶液调pH = 7,制成山羊角水解液。

山羊角提取物溶液的制备:

准确称取山羊角提取物约0. 5 g,溶入10 mL 水中,制成山羊角提取物溶液。取山羊角水解液及山羊角提取物溶液各1 mL,用0. 45 μm 滤膜过滤。并与氨基酸自动分析仪所用盐酸溶液等比例混合,供检测。

2. 1. 2 氨基酸自动分析

调整仪器参数及洗脱液pH,使各氨基酸分辨率≥85%,分别自动进样制备好的山羊角水解液和山羊角提取物溶液各20 μ进行分析,其中缓冲溶液流速为0. 400 mL ·min  1。茚三酮溶液为0. 350 mL ·min  1。结果见图1

2. 2 傅立叶变换离子回旋共振质谱

2. 2. 1 质谱条件

扫描方式为电喷雾负离子模式,扫描范围: 0  300 m/z,干燥气温度: 200 ℃,干燥气流量: 12 L ·min 1,雾化气流量: 6 L ·min  1,电喷雾电压为2. 3 kV。注射泵进样速度μ·min  12. 2. 2 样品处理取微量山羊角提取物,溶于甲醇中,加入适量乙酸,促进其离子化。用0. 25 mL 注射器吸取一定体积样品液固定在注射泵上,直接进样。2. 2. 3 质谱结果见图2

2. 3 焦谷氨酸的确定

从氨基酸自动分析仪上我们可以很清楚地看出,山羊角提取物与山羊角水解液的氨基酸有一定的差别,而谷氨酸含量zui多且差别较大见图1) 。根据分析认为种可能性是山羊角提取物中谷氨酰胺水解不*所导致,而谷氨酰胺在酸性环境下可转化为谷氨酸而另种可能性是谷氨酸在山羊角处理过程中转化为其他物质。但考虑到山羊角提取物为山羊角在过量硫酸中于106 ℃处理16h,水解较*,可以排除第种可能性而在山羊角提取物制取过程中有烘干步骤,且谷氨酸加热后易脱水转化为焦谷氨酸3) 。为了验证上述的判断,对山羊角提取物进行高分辨质谱分析。结果发现了m/z 128. 03548 离子峰,其匹配*分子式为C5H6NO3,因其是ESI 模式下,主要的离子化反应是质子转换和电荷交换,因此可能形成M-。所以分子式应为C5H7NO3,符合焦谷氨酸的分子式,而m/z 146. 04642离子峰,其分子式应为C5H9NO4,确定其为谷氨酸,并且没有谷氨酰胺的分子峰出现。此后的液相分析也佐证了的判断,在相同时间,焦谷氨酸标准品与山羊角提取物供试品有同一时间峰。故可以肯定山羊角提取物中含有焦谷氨酸。

3 含量测定

3. 1 色谱条件

采用Sionchrom ODS - BP 色谱柱( 200 mm × 4. 6 mm,5 μm) ,以流速为1. 0 mL·min - 1,检测波长205 nm,柱温27℃。流动相: 乙腈- 3. 5 mmol·L - 1 磷酸氢二钠缓冲液( 1∶ 99) ,用磷酸调pH = 3,上样20 μL。

3. 2 溶液的制备

3. 2. 1 对照品溶液

称取焦谷氨酸对照品适量,用流动相配成136 μg ·mL - 1的溶液。

3. 2. 2 供试品溶液

取山羊角提取物约1 g,精密称定,置于1 L 量瓶中,用流动相定容即可。

3. 3 线性关系考察

将对照品溶液等倍稀释为136, 68, 34, 17, 8. 5 μg ·mL - 1,按上述液相条件分别进样测定。以对照品量为( X)为横坐标,峰面积积分值( Y) 为纵坐标,得回归方程为:Y = 15. 08X + 28. 88 r = 0. 999线性范围8. 5 ~ 136 μg。

3. 4 精密度试验

取对照品溶液,在上述色谱条件下连续进样5 次,每次进样20 μL,测得焦谷氨酸色谱峰面积的分别为1098. 49,1101. 26,1089. 04,1106. 52, 1092. 27 mV。其RSD 为0. 64% ( n = 5) ,结果表明精密度良好。

3. 5 稳定性试验

取同一供试品溶液,在上述色谱条件下,分别于0,1,2,4,8,12, 24 h 各取20 μL 进样测定,峰面积分别为1127. 71,1121. 52,1117. 47,1119. 42, 1112. 5, 1104. 71, 1109. 55 mV,测得焦谷氨酸色谱峰峰面积的RSD 为0. 70% ( n = 7) ,表明供试品溶液在24 h 内稳定。

3. 6 加样回收率试验

取批号为091001 的样品( 含量为7. 65%) 0. 01 g 各9 份,精密称量后,按3个水平加入“3. 2. 1”项下136 μg ·mL -1溶液1,2,5mL 各3 份,定容于10 mL 量瓶中,流动相定容,按上述色谱条件分别进样20 μL,计算回收率。低、中、高浓度回收率( n = 3 ) 分别为99. 8%,100. 1%,100. 0%; RSD 分别为0. 25%, 0. 18%,0. 03%。

3. 7 方法专属性试验

取焦谷氨酸标准品、谷氨酸、谷氨酰胺对照品各10. 0 mg,混合后用流动相定容于100 mL 量瓶中。按上述色谱条件取样20μL进样测定。结果显示谷氨酸、谷氨酰胺色谱峰的出峰时间均不同于焦谷氨酸出峰时间,对焦谷氨酸检测无干扰。结果见图4。

3. 8 检测限及定量限

将“3. 2. 1”项下对照品溶液依次稀释至不同浓度,按上述色谱条件分别取样20 μL 进样测定。按信噪比分别为3 和10 时进行检测限及定量限测定。焦谷氨酸的检测限及定量限分别约为0. 136 μg 和0. 425 μg。

3. 9 含量测定

吸取20 μ供试品溶液,按照上述色谱条件进行测定,按照峰面积外标法,进样次,峰面积分别为1127. 711115. 251112. 14 mV。计算出第091001 批山羊角中焦谷氨酸的含量为7. 65%RSD = 0. 74% ( n = 3)。结果见图5

4 讨论

在山羊角提取物中发现的焦谷氨酸此前没有相应的检测标准,而本文所建立的液相色谱检测方法具有专属性强,检测方便,出峰时间快等特点,是一种适宜检测山羊角提取物中焦谷氨酸含量的方法。

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