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超液相色谱法测定鸡组织中二硝托胺及其代谢产物残留量
更新时间:2017-05-12   点击次数:1769次

二硝托胺因其毒性小,防治球虫效果好而得到普遍应用,但长期高浓度使用会造成药物残留,对人体健康造     害我    235号公告中规定二硝托胺的zui大残留*以亲体和代谢产物(3-Amino-5-nitro-o-toluamideANOT)总量计,鸡肉和鸡肝中分别为30006000!g/kg目前尚缺乏相应的残留分析物标准方法,因此有必要开展测定鸡组织中二硝托胺和ANOT残留量的分析方法研究。

实验部分

21仪器与试剂

Waters超液    ( Waters ,配二极管阵列检测器;AcquityBHEC18  (100mm×21mm17!m) ;固相萃取仪(美国Supelco公司) ;HLB小柱(3mL60mgWaters公司) ;Sigma离心机;Ultra-TyrraxT25型匀质器(德国)

二硝托胺和ANOT标准品(DrEhrenstorfer公司) ;甲醇和乙腈(色谱纯,Merck公司) ;甲酸(色谱纯,Tedia公司) ;KH2PO4K2HPO4·3HO2(分析纯,上海化学试剂公司) ;磷酸盐缓冲液(pH6040)

22色谱分离条件

流动相:A01%甲酸,B为乙腈。梯度洗脱:010min80%A;1040min80%30%A;4050min30%A;5051min30%80%A;5170min80%A。流速02mL/min,进样量10!L,检测波长317nm;柱温30°C

23样品处理

准确称取2g试料于50mL离心管中,在鸡肉和鸡肝中分别加入pH70pH40的磷酸盐缓冲液10mL,以10000r/min速度匀质1min,再以8000r/min离心5min,收集上清液;在残渣中再加入10mL磷酸盐缓冲液,同样步骤操作后合并上清液;4mL上清液调至pH70,再以8000r/min离心5min,上清液加入到已经被3mL甲醇和3mL水活化的HLB小柱中,待净化液液面到达柱吸附层表面时加入3mL水淋洗,抽干柱子,用4mL01%甲酸-乙腈(8020V/V)洗脱,收集洗脱液,过022!m滤膜,供LC分析。

3结果与讨论

31色谱条件的建立

210800nm范围内对二硝托胺和ANOT的标准溶液进行扫描(1) ,二硝托胺存在两个zui大1二硝托胺(a)ANOT(b)光谱分别在21603008nm;ANOT至少存在两个zui大吸收峰,分别为31745269nm。考虑到ANOT的灵敏度低于二硝托胺,为尽量提高ANOT的灵敏度,避免干扰峰,本实验选择317nm进行分析。

采用梯度洗脱对二硝托胺和ANOT进行同时分析时,初始流动相中有机相比例大于25%时,ANOT和二硝托胺出峰太快,易受杂质干扰;而有机相比例低于15%时,ANOT由于出峰较迟而易受杂质干扰。本实验将初始流动相中水相和有机相的比例定为82。从图2 知,二硝   ANOT    较好,在空白组织中未见干扰。

32提取和净化条件的选择

二硝托胺和ANOT极性较强,且易溶于酸性溶液,本实验采用磷酸盐缓冲液pH(4567)提取鸡肌肉和鸡肝样品(3)。当pH=60时,肌肉样品中二硝托胺和ANOT的提取回收率均高于90%;于肝脏样品,pH=4070时,提取效果越来越差,仅pH40时,二硝托胺和ANOT的提取回收率高于90%。因此,提取样品时,肌肉和肝脏样品分别采用pH60pH40的磷酸盐缓冲液。

而对实验发现,鸡肉提取液直接进行固相萃取净化时,ANOT的回收率仅约40%,且HLB小柱换成BondElutC18小柱后,回收率无明显改善。而鸡肉提取液调至pH70后进行实验,过HLB小柱,回收率大于90%;BondElutC18柱,回收率无明显改善。本实验采用HLB小柱进行净化。

33线性实验

称取二硝托胺和ANOT标准品各100mg100mL容量瓶中,用乙腈定容,得100mg/L的标准储备液。用01%甲酸-乙腈(8020V/V)稀释,配制2010020050010002000!g/L系列标准工作液,进行LC分析,每个浓度进样3次,以标准溶液的浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。实验结果表明,二硝托胺和ANOT的线性范围为202000!g/L,标准曲线方程分别为y=2066x10497(ANOT)y=2115x17878(二硝托胺,相关系数(r)均高于09998。本方法适用于二硝托胺和ANOT的定量分析。

34方法的检出限、回收率和精密度

采用在空白样品中添加标准溶液的方法,对鸡肉和鸡肝样品进行了3次添加回收实验,每个浓度点重复进 6次,结   1。鸡肉和鸡肝中各浓度点二硝托胺和ANOT的平均添加回收率均在792%881%之间。批内相对标准偏差(RSD)均在27%52%之间,批间RSD均在41%69%之间,方法具有较好的准确性和稳定性。同时按信噪比S/N=31计算得两种组织中的检出限为550!g/kg(ANOT)250!g/kg(二硝托胺)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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