安捷伦液相色谱仪HPLC测定水产品中孔雀石绿

孔雀石绿是有毒的三苯甲烷类化学物，既是染料，也是杀菌剂，可致癌。孔雀石绿可用作治理鱼类或鱼卵的寄生虫、真菌或细菌感染，对付真菌Saprolegnia特别有效，渔场的鱼卵会感染这种真菌。孔雀石绿也常用作处理受寄生虫影响的淡水水产。用作抑菌剂或杀阿米巴原虫剂；对脂鲤和鲶鱼等海产动物来说，有高度毒性、高残留等副作用，故使用时，通常只下一半份量。但一些水产品贩运商为保持水产品新鲜度普遍用MG消毒车厢和活鱼池；酒店为了延长鱼的存活时间也在鱼池中投放MG进行消毒。使用MG消毒后的鱼即使死亡后颜色也较为鲜亮，消费者很难从外表进行辨认。虽然MG已被列为水产养殖禁用药物，但因为其价格低廉，同时目前在水霉病防治上尚无其它有效药品，因此仍有一些水产养殖户在普遍使用。

孔雀绿石

 材料与方法

1.     1材料

1.1.1试剂

    乙睛 色谱纯，fishte ；

    乙酸铵 ，hplc纯 ，DIKMA；

    孔雀石绿（MG） sigma试剂；

    无色孔雀石绿（LMG）  sigma试剂。

0.125mol/L乙酸铵溶液  称取乙酸铵9.64 g，用纯水溶解并定容至1000mL。用0.45μm滤膜过滤。

MG标准储备液  准确称取孔雀石绿0.100 0g，用乙睛溶解并定容至100 mL。该标准溶液浓度为1mg/mL。避光、冰箱冷冻层保存。     

MG标准应用液 吸取1mg/mL孔雀石绿标准储备液用乙睛稀释至1.0μg/mL。

LMG标准储备液 准确称取孔雀石绿0.100 0g，用乙睛溶解并定容至100mL。该标准溶液浓度为1mg/mL。

    LMG标准应用液  吸取1mg/mL无色孔雀石绿标准储备液用乙睛稀释至1.0μg/mL。

MG和LMG标准混合溶液  分别吸取MG和LMG标准储备液，用乙睛稀释成不同浓度的标准混合溶液。

1.1.2 仪器

安捷伦液相色谱仪。具UV-VIS、在线脱气机、高压泵、柱恒温箱、色谱工作站。

1.2 步骤

1.2.1 色谱条件

   检测器  紫外-可见光检测器，波长618nm；

   色谱柱  氰基柱，4.6mm×250mm，5μm；

   流动相  乙睛-0.125mol/L乙酸铵（pH4.5）=（47+53）；

   柱温  35℃；

   进样量  20μL。

1.2.2  测定步骤 

吸取MG和LMG标准混合溶液（5.0μg/mL）注入色谱仪，在上述色谱条件下，绘制色谱图。见图1。

   （安捷伦液相色谱仪）

2.结果与讨论

2.1流动相的选择 MG和LMG的HPLC法分离，无论是C18柱还是氰基柱，多采用乙睛和乙酸铵作流动相的反相体系（1～4）。其中乙酸铵浓度对MG和LMG的分离有很大影响。对于梯度洗脱方式多采用50mmol/L乙酸铵溶液（2、3），而等梯度洗脱方式乙酸铵溶液浓度较大（0.125mol/L）（1）。

2.2 流动相溶剂比例的影响  在上述色谱条件下，用1.0μg/mL MG和LMG标准混合溶液在不同比例（V/V）乙睛-0.125mol/L乙酸铵溶液中观察分离效果，结果表明，在乙睛-乙酸铵溶液（pH4.5）=47+53时分离效果好，灵敏度zui高，所以选择该溶剂比为流动相为。见表1。

2.3zui低检测浓度  在上述色谱条件下，以3S/N的响应信号为zui低检测浓度，LMG的zui低检测浓度为0.02μg/mL，MG的zui低检测浓度为0.05μg/mL。均能满足试验要求。见图2。

由图可见，以取样量10.0g计，zui低检测浓度LMG为2μg/kg，MG为5μg/kg。

2.4 线性范围试验  在上述色谱条件下，LMG和MG线性关系均良好。LMG和MG线性范围为2μg/mL～160.0μg/mL，r ＞0.999。其中LMG和MG在0.2μg/mL～10.0μg/mL范围的校正曲线见图3；1.0μg/mL～160.0μg/mL范围的校正曲线见图4。

2.5精密度试验

在上述色谱条件下，分别用1.0μg/mL、5.0μg/mL和10.0μg/mL LMG/MG混合标准溶液进行平行性测定。保留时间相对标准偏差（RSD）一般小于0.4%，峰面积相对标准偏差小于5%。见表2。

3样品测定

3.1 样品处理

3.2样品测定

3.2.1校正曲线的绘制

3.2.2样品测定

3.3 加标回收率测定

4结论

      LMG和MG毒性强、具有很高的三致作用，其对水产品的人为污染应受到严重关切。

液相色谱仪测定水产品中LMG和MG，具有方法简便、分离效果好、分析速度快、节省试剂、精密度高、灵敏准确、线性范围宽等优点，适用于水产品中LMG和MG含量检测。

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