液相色谱仪HPLC测定石杉碱甲的含量
石杉碱甲是石杉科植物中提取的一种生物碱,是一强效的胆碱酯酶可逆性抑制剂,其作用特点与新斯的明相似,但作用维持时间比后者为长。对真性胆碱酯酶具有选择性的抑制,抑制强度是假性胆碱酯酶的数千倍;抑制方式为竞争性和非竞争性的混合型抑制,与单纯竞争性抑制剂有显著不同;易通过血脑屏障进入中枢,兼具有中枢及外周治疗作用;有效时间长;从胃肠道吸收良好;安全指数大;稳定性好。
由于蕨类植物生长缓慢,繁殖困难,造成了石杉碱甲的原料药价格昂贵,因此,建立一个石杉碱甲含量的快速检测方法很有必要。为了科学、合理地利用石杉属植物资源,采用HPLC法对石杉中石杉碱甲的含量进行测定,为寻找和筛选石杉碱甲新的植物资源提供科学依据。
1、仪器与试药
安捷伦液相色谱仪HPLC((带四元泵,自动进样器,紫外检测器等);梅特勒天平;KQ50B超声清洗器;电热恒温水浴锅;石杉碱甲对照品(100243-200401);乙腈(色谱纯);二次重蒸水;其他试剂均为分析纯。
实验药材采至贵州黔东南,由贵州科学院生物研究所王培善教授鉴定为昆明石杉,标本存放于贵阳中医学院民族医药研究所,标本凭证(20056)。
昆明石杉
2、液相色谱仪HPLC测定石杉碱甲的含量方法与结果
2.1色谱条件
ZORBAXSB-C18色谱柱(150mm×4.6mm,5μm),流动相0.02mol·L-1磷酸二氢钾-乙腈 (92∶8),检测波长为310nm,流速1ml·min-1,柱温25℃,进样量为5μl。在此色谱条件下,样品中的石杉碱甲与其他峰能达到基线分离, 其理论塔板数为4656,对称因子为0.92。石杉碱甲的保留时间为11.15min。
2.2样品的制备
精密称取实验药材细粉2g于500ml的圆底烧瓶中,每次加入200ml石油醚提取3次,弃去滤液。滤渣再用95%的甲醇提取3次,合并滤液并 回收溶剂,加入2%的酒石酸溶解,用氨水调节pH值至8.0,再用氯方萃取至Dragendorffors反应呈阴性,挥干有机溶剂,用无水乙醇溶解并定 容至25ml即得。
2.3线性关系的考察
精密称取石杉碱甲对照品2.40mg于25ml容量瓶中以无水乙醇溶解并定容,得浓度为0.096mg·ml-1对照品溶液,再分别稀释成 0.096,0.048,0.024,0.012,0.006,0.003mg·ml-1的对照品供试液,在色谱条件下测定。以进样浓度对峰面积进行回 归,得方程:Y=6776.0151X1.0305,r=0.99995。可知石杉碱甲在0.015~0.48μg之间与峰面积呈良好线性关系。
2.4精密度实验
取石杉碱甲对照溶液,在色谱条件下重复进样6次,结果石杉碱甲峰面积的RSD为0.36%(n=6)。
2.5稳定性实验
取供试品溶液,每隔2h测定1次,考察石杉碱甲的含量变化,结果含量的RSD为0.85%(n=6),表明供试品在10h内稳定。
2.6重复性实验
精密称样品6份,按“2.2”项的要求制备6份供试液,在色谱条件下分别进行测定,结果Hup-A含量的RSD为0.60%(n=6)。
2.7回收率实验
精密称取昆明石杉药材细粉6份,每份1g,分别加入对照品供试液(0.003mg·ml-1)100ml,按样品制备方法和色 谱条件,制备加样回收供试液进行测定,计算回收率(见表1)。结果石杉碱甲的平均回收率为99.63%,RSD=0.56%(n=6)。表1石杉碱甲加样 回收率实验结果(略)
2.8样品的测定
按“2.2”项的要求精密称取样品3份,制备供试液,按色谱条件进行测定,重复3次,取平均值,石杉碱甲在原植物中的平均含量为0.03%。
3、液相色谱仪HPLC测定石杉碱甲含量的结论
我们建立了用HPLC反相柱从石杉总碱中直接测定石杉碱甲的方法,该方法线性与精密度良好,平均回收率为99.89%,平均RSD为0.40%。实验证明该方法易行、灵敏、准确、可靠。在生产石杉碱甲的工作中得到了证实。
测定方法是在其它石杉中石杉碱甲含量测定方法的基础上,改用ZORBAXSB-C18色谱柱及以0.02mol·L-1磷酸二氢钾-乙腈(92∶8)为流动相。
从石杉碱甲原植物中提取总生物碱,是一个常规和稳定的方法。通过测定总碱中石杉碱甲的含量,便可以推算出原植物中石杉碱甲的含量。该方法已经成为检定原植物的方法并应用于工作中。