1实验部分

1.1材料、仪器及试剂

供试材料16个,由中国农业科学院油料作物研究所提供,其中稳定的品种及品系材料13个,分别为中油821、1008、5899、6098、M1、R1、R6、168、H8003、8908、8007、TR008和Y001,F1代材料3个分别为6098/1008、6098/M1和5899/1008。薹期取10个单株第3、4片新叶混合,保鲜袋密封保存于-45°C低温冰箱冰冻干燥20h,贮存于-40°C低温冰箱备用。

MODULOD2230冰冻真空干燥仪;电热鼓风热干燥箱;DW2FL135低温冰箱;KQ2800KDE型超声波清洗器和SigmaZK15冷冻离心机。waters液相色谱系统,510型梯度泵,470型自动进样器,2487型紫外检测器,检测波长229nm,NovapakC18色谱柱,柱温30°C,进样量10μL,流动相流速为1mL/min,洗脱液为100%水-20%乙腈梯度洗脱。

实验所用试剂均为色谱纯,丙烯基硫甙和苯甲基硫甙标准样品购自Sigma公司。

1.2实验方法

1.2.1叶片硫甙含量计算

根据惯例测定结果采用丙烯基硫甙或苯甲基硫甙作为色谱内标物根据保留时间对硫甙进行定性、定量,以每克叶片干粉所含硫甙微摩尔数表示(μmol/g),硫甙分量计算公式如下:

式中,G.硫甙分量;Ag.脱硫硫甙峰面积的数值;As.标准脱硫硫甙峰面积的数值;Kg.脱硫硫甙相对校正系数;m.试样质量的数值,单位为g;n.加入标准物质的量,单位为μmol。

1.2.2样品前处理方法

分别采用液氮、电热鼓风热干燥和冰冻干燥3种不同方法处理供试材料,确定试验*的干燥方法。

准确称取01200g粉碎样品于10mL聚丙烯圆底离心管中,75°C水浴杀活1min,加70%(φ)甲醇2mL,内标200μL(不含丙烯基的样品加丙烯基为内标,否则加苯甲基为内标)涡旋混合,分别用超声波提取、75°C水浴提取和高速旋转匀浆机3种提取方式进行提取。

1.2.3HPLC色谱条件

本实验采用液相色谱分离梯度洗脱。流动相A:100%水;流动相B:20%乙腈。0～10min,A为85%～0;10～12min,A为0;12～15min,A为0～85%。流速1mL/min。

1.2.4叶片硫甙回收率和方法精密度实验

用高、中、低硫甙3种甘蓝型油菜叶片进行苯甲基硫甙标准样品加标回收率实验。对油菜叶片样品进行10次重复测定,计算极差和相对标准偏差,确定油菜叶片测定方法的精密度。

2结果与讨论

2.1叶片样品干燥前处理方法与检测结果

油菜叶片为鲜活样品,其硫甙含量与组分分析有特殊性,与种子中硫甙测定不同,当油菜叶片组织被机械损伤或受到病虫害侵袭时,可引起叶片硫甙含量急剧变化。实验分析了液氮、加热干燥和冰冻干燥3种方法对油菜叶片中硫甙含量测定结果的影响,结果表明:液氮处理样品的测定结果较好,但操作复杂,不适用于大批量样品分析。加热干燥处理样品过程中因部分硫甙降解,造成测定结果偏低。冰冻干燥测定结果准确,检测灵敏度高,分析效率高,可操作性强,适于批量样品处理分析。因此实验采用冰冻干燥方法进行油菜叶片样品前处理。

2.2叶片硫甙提取技术与检测结果

以超声波、75°C水浴和高速旋转匀浆机不同的提取硫甙方式进行提取效率比较,结果见表1。由结果可以看出:水浴方法提取时间较长,且硫甙含量的测定结果偏低;高速旋转匀浆机提取使结果显著低于其它两种提取方式;超声波提取具有提取率高、时间短、对提取成分影响小、重复性好等优点,用于油菜叶片中硫甙的提取,可以节约分析时间,简化操作,提高工作效率。

2.3叶片硫甙含量的加标回收率

选取叶片硫甙含量不同的甘蓝型油菜样品,添加苯甲基硫甙标准样品,进行加标回收试验,结果见表2。不同叶片硫甙总量水平下,分别加入015、510和1010μmol标准样品,油菜叶片硫甙加标回收率均达94%以上,且结果稳定,回收率变化范围为94%～103%,表明该方法准确可靠。

2.4方法精密度实验

对相同油菜叶片样品10次重复处理。测定均值为8138μmol/g,极差为2129μmol/g。每个样品值与均值之偏差均小于2μmol/g,极差小于3μmol/g,误差在油菜种子硫甙测定标准(ISO9167:1-1992)规定范围之内,RSD为8112%,表明该方法重复性较好。

2.5不同油菜叶片硫甙含量与成分分析

用建立的油菜叶片硫甙总量与分量测定方法,对芥菜型、白菜型和甘蓝型油菜薹期叶片进行分析,具体结果见表3及图1～3。

不同类型油菜品种,其薹期叶片硫甙含量不同,各组分在3类油菜叶片中差异很大。芥菜型油菜叶片仅含有丙烯基硫甙和32丁烯基硫甙两种组分,但含量较高,分别为8196μmol/g和5140μmol/g;白菜型油菜叶片主要含32丁烯基硫甙、32吲哚甲基硫甙和42戊烯基硫甙,且3种组分含量都较低,分别为0130、1179和0125μmol/g;甘蓝型油菜叶片含较多硫甙组分,其中以22羟基232丁烯基硫甙、32丁烯基硫甙和吲哚类硫甙为主,含量分别为7121、4103和2169μmol/g。

前人研究结果表明，油菜种子中硫甙芥菜型以丙烯基硫甙为主;白菜型以32丁烯基硫甙和42戊烯基硫甙为主;甘蓝型以22羟基232丁烯基硫甙、32丁烯基硫甙和42戊烯基硫甙为主。可见,不同类型油菜中,叶片硫甙与种子硫甙的主要组分不尽一致,关于两者之间的关系有待于进一步系统研究。本试验油菜叶片硫甙与组份测定HPLC方法的建立,为油菜定向杂交育种与抗性品种选育提供了检测手段支持。