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液相色谱法测定猪组织中残留的咪唑苯脲
更新时间:2017-04-27   点击次数:1752次

仪器与材料

液相色谱仪,含SPDM20A二极管阵列检测器,CBM20A系统控制器,CTO20A柱温箱;梅特勒EL204十万分之一分析天平;自动双重蒸馏水蒸馏器;数控超声仪;旋转蒸发仪;C605中压制备色谱仪。

芦丁、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、江户樱花苷、槲皮素、山柰酚对照品均由本实验室分离得到,经MS1H-NMR13C-NMR确定结构,HPLC峰面积归一化法分析质量分数均达到98%以上。珍珠菜药材(批号分别为200801200802200803。乙腈为色谱纯,水为二次蒸馏水,其余试剂为分析纯;色谱硅胶。

2方法与结果

2.1珍珠菜提取物的制备

取珍珠菜干燥药材,用10倍量80%乙醇提取3次,合并提取液,加水沉淀除去弱极性物质,上清液浓缩至无醇味,滤过,滤液上AB-8大孔树脂,上样后先用水洗脱至无色,再依次用40%95%乙醇洗脱,将40%乙醇洗脱部位浓缩、冷冻干燥成粉末,即得珍珠菜提取物。

2.2色谱条件

色谱柱为Chromasil C18柱(250 mm×4.6 mm5.0 μm);流动相为乙腈(A-0.1%磷酸水溶液(B),梯度洗脱:020 min13%35% A2030 min35%100% A;体积流量1.0 mL/min;双波长检测λ1283 nm(江户樱花苷),λ2370 nm(芦丁、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、槲皮素、山柰酚);柱温35 °C。色谱图见图1

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2.3对照品储备液的制备

精密称取各对照品适量,用甲醇溶解并定容,分别得到含芦丁381.0 μg/mL、异鼠李素-3-O-芸香糖苷166.0 μg/mL、江户樱花苷387.0 μg/mL、槲皮素55.2 μg/mL、山柰酚25.2 μg/mL的对照品储备液。

2.4供试品溶液的制备

精密称取珍珠菜提取物样品25.0 mg,置25 mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,摇匀,过0.45 μm膜,即得供试品溶液。

2.5线性关系考察

分别精密量取芦丁、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、江户樱花苷和山柰酚对照品储备液各15.012.09.06.03.0 mL及槲皮素对照品储备液10.08.06.04.02.0 mL,分别置100 mL量瓶中,甲醇稀释并定容至刻度,摇匀,配制成一系列质量浓度的混合对照品溶液,精密吸取各混合对照品溶液20 μL,分别注入液相色谱仪,测定,以进样量为横坐标,峰面积为纵坐标进行线性回归,得回归方程(表1),各对照品与峰面积线性关系良好。

2.6检测限

取上述对照品储备液,定量稀释成不同质量浓度对照品溶液后,直接进样,直到某一进样量出峰峰高为仪器噪音的3倍时,即为该对照品的检测限,结果见表1

2.7精密度试验

吸取上述5种混合对照品溶液20 μL,重复进样6次,计算峰面积的RSD,即为日内精密度;连续检测3 d,每天检测2次,计算峰面积的RSD,即为日间精密度,结果见表1

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2.10回收率试验                              

精密称取9份批号为200801的珍珠菜提取物样品,每份约4.0 mg,分别置5.0 mL量瓶中,平均分成3组,按照样品中每种待测成分量的80%100%120%定量加入5种对照品,甲醇定容,分别取20 μL进样分析,外标法计算各成分平均回收率。结果芦丁、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、江户樱花苷、槲皮素、山柰酚的平均回收率分别为97.8%98.9%102.4%98.4%92.2%RSD分别为2.70%1.71%1.16%0.50%3.81%

2.11样品测定

3个批次的珍珠菜提取物样品,制备供试品溶液,分别进样20 μL,测定,外标法计算,结果见表2

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3讨论

实验结果表明不同批次珍珠菜提取物样品间所测化学成分的量相差不大。黄酮类化合物既是珍珠菜提取物中的主要成分,又是主要的抗肿瘤活性成分,通过测定发现芦丁、江户樱花苷等黄酮苷的量较高,而槲皮素、山柰酚等苷元的量较低,故可用芦丁、江户樱花苷为指标来控制提取物中黄酮类和二氢黄酮类的量。本方法操作简便快捷,结果准确可靠,重复性好,灵敏度高,可用于珍珠菜提取物中黄酮类化合物的质量控制。

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