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气相色谱仪GC测定脂肪酶的活力
更新时间:2017-05-02   点击次数:2331次

材料与方法

实验试剂与仪器

黑曲霉属脂肪酶(S-7449 from Aspergillus niger,三丁酸甘油酯; 考马斯亮蓝G-250; 奥利司他; 聚乙烯醇(简称PVA, 聚合度1750); 其他试剂为国产分析纯;实验用水为双蒸水。

超级恒温水浴锅;高速离心机;精密PH计;超声仪;安捷伦气相色谱仪带FID检测。

色谱条件Supecl-NUKOLTMFFAP毛细管柱(固定相为对苯二甲酸改性的聚乙二醇;30 m × 0.53 mm × 0.5 μm),柱温100 °C,保持5 min,以20 °C·min−1的速率升温至180 °C后,保持6 min。分流。进样口温度250 °C,检测器温度250 °C,载气(氮气)流速10 mL·min−1,氢气流速30 mL·min−1,空气流速300 mL·min−1,尾吹30 mL·min−1。进样量1 μL。

溶液的配制

正丁酸标准溶液:精密称取正丁酸适量,用乙腈稀释,配制成8个不同浓度的正丁酸标准溶液。

脂肪酶溶液:精密称取适量酶粉,溶于pH 7.5的0.1 mol·L−1Tris-HCl缓冲液10 mL中,超声20 min,离心10 min(3 500 r·min−1)。取上清液作为酶反应液。脂肪酶蛋白浓度以考马斯亮蓝法测定。

三丁酸甘油酯乳化液:精密量取三丁酸甘油酯1 mL,以2%PVA溶液定容至10 mL,超声20 min。

脂肪酶活力的检测

测定原理:三丁酸甘油酯在脂肪酶的作用下水解成甘油和正丁酸。产物正丁酸可以通过气相色谱进行定量分析。由此,可以计算出脂肪酶的活力单位。

脂肪酶活性测定:反应总体积为500 μL。空白组组成为:底物乳化液100 μL,pH 7.5的Tris-HCl缓冲液400 μL。实验组组成为:底物乳化液100 μL, pH 7.5的Tris-HCl缓冲液200 μL,酶液200 μL。在32 °C水浴反应5 min后,加入乙腈800 μL终止反应, 振荡10 s,离心10 min(10 000 r·min−1),取上清液进样分析。

脂肪酶活力单位定义:在pH为7.5,温度为32 °C条件下,每分钟催化三丁酸甘油酯水解生成1 μmol正丁酸的量,定义为一个酶活力单位。计算公式为:

 

X为脂肪酶活力(U·mg1); B为实验组产生的正丁酸的量(μmol); A为空白组产生的正丁酸的量(μmol); C为体系中所含酶量(mg); t为反应时间(min)。

脂肪酶抑制活性的检测

原理:脂肪酶抑制剂(奥利司他)能抑制脂肪酶活性,通过比较有无抑制剂加入情况下生成的正丁酸量的差异,来评价脂肪酶抑制剂对脂肪酶活性的抑制程度。

测定方法:按上述方法,在反应液中加入奥利司他甲醇溶液100 μL 后,测定生成的正丁酸的量。

结果与讨论

1正丁酸标准曲线

正丁酸在0.11~11.35 mmol·L1内,峰面积(y) 与浓度(x) 的回归方程为: y = 45 464x −3 115.2, r = 0.996 8。结果表明正丁酸的浓度与峰面积线性关系良好,因此可用气相色谱外标法对正丁酸进行定量检测。

2zui适pH值和反应温度的选择

脂肪酶在碱性条件下具有较高的活力,*pH值为7.48。如图所示。

 

 

不同来源的脂肪酶具有不同的zui适反应温度。通常,猪胰脂肪酶的zui适反应温度为37 °C左右;黑曲霉属脂肪酶在25~35 °C具有较高的酶活,本文所测zui适反应温度为(31.6 ± 0.5) °C,如图所示。

 

 

3反应时间和方法专属性

正丁酸在5 min左右就能被检测到,且峰形良好, 如图3所示。脂肪酶水解样品中,正丁酸与其他杂质能达到很好的分离效果。

 

 

4终止剂的选择

每种终止剂平行测定3次,表中所列差值范围为平行样的标准偏差范围。结果下表。本文选用乙腈作为反应终止剂。

 

 

在未经反应的实验组溶液中分别加入浓度为0.22, 1.14和5.68 mmol·L−1的正丁酸标准溶液, 通过检测并计算正丁酸的平均回收率来考察本方法的准确性和精密性。平均回收率分别为90.3%, 104.6%和89.4%; RSD值分别为3.01%, 4.50%和6.64% (n = 3)。

6脂肪酶米氏常数的测定

该实验方法下米氏常数Km值为0.25 mmol·mL1。结果如图4所示。

 

 

7奥利司他溶剂的选择及其IC50值的测定

为了进一步验证方法的可靠性,在反应体系中加入奥利司他溶液,测定其对脂肪酶的抑制作用。奥利司他极性很小,通常只溶于氯fang、甲醇、二甲亚砜(DMSO) 和四氢呋喃(THF) 等有机溶剂。由于氯fang与缓冲溶液不互溶,DMSO对正丁酸峰产生干扰, 本文仅考察了甲醇和THF对酶的抑制情况。体系中16.7% (加入量100 μL) 的甲醇或THF对酶的抑制率分别为47.9%和89.4%。所以本文选择抑制活性较小的甲醇作为奥利司他的溶剂。以甲醇空白液为对照(抑制率为0),计算出IC50值为0.048 5 mg·mL−1,

结论

以气相色谱检测脂肪酶活力的方法克服了滴定法重现性差和准确性低的缺点,具有反应体积小,反应时间短,检测速度快等优点,适合于脂肪酶活力的测定及其抑制剂的筛选。

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